DNA条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法技术

本发明专利技术公开了DNA条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法，属于枸杞种属鉴定技术领域。本发明专利技术利用枸杞的psbH‑petB的DNA条形码鉴定枸杞品种、确定枸杞种间关系的方法，同时在该方法基础上获得psbH‑petB条形码数据库，通过将待鉴定样品的psbH‑petB序列与所述psbH‑petB条形码数据库中的序列进行比对，能够有效地对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，为枸杞品种提供有效的依据。

【技术实现步骤摘要】
DNA条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法
本专利技术属于枸杞种属鉴定
，具体涉及DNA条形码序列及其鉴定枸杞种属的方法。
技术介绍
宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是我国名贵的道地药材，具有抗氧化、抗肿瘤、软化血管、降脂、降糖、生精、保肝、明目、增强人体免疫力等功效。由于道地药材与非道地药材常有相同的基原或为近缘，使得它们在外在形态、习性、组织构造及所含化学成分等方面具有高度的相似性，传统的鉴定方法难以作出准确鉴别。DNA条形码(DNAbarcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对目标物种进行识别和鉴定的一项新技术，它具有操作简便、准确性高、鉴定快速等特点，已成为现代生物类学研究中引人注目的新方向和研究热点。但是目前枸杞属的条形码数据库在物种丰富度及数量上都相对欠缺，仍需进行大量的研究。近些年来，国内外学者对适合用于鉴定植物的DNA条形码基因序列进行了积极的探索与研究。公开号为CN106282390A的专利技术专利《宁夏枸杞和枸杞SNP快速鉴定方法》，公开了一种宁夏枸杞和枸杞SNP快速鉴定方法，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQIDNo.1所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQIDNo.1所示的序列，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位为C，第200位为G，则鉴定为宁夏枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位为T，第200位为A，则鉴定为枸杞。本专利技术能够实现宁夏枸杞、枸杞原植物、药材和生饮片的快速、准确鉴定。文章《基于nrDNAITS序列对枸杞雄性不育材料的鉴别》，公开了对7份常规枸杞种质和1份枸杞雄性不育材料的DNA中nrDNAITS(核糖体DNA基因内转录间隔区)序列进行分析,从分子水平对枸杞雄性不育材料作出鉴定。采用改进CTAB法提取枸杞叶片DNA,利用合成的特异引物对其DNA中nrDNAITS区进行扩增、克隆,对目的片段测序分析。结果显示首次测序得到了枸杞雄性不育材料和其他7份常规枸杞种质的nrDNAITS区碱基序列,整个ITS序列长度559～633bp,平均为612bp,共有160个变异位点,占25.3％；保守位点473,占74.7％；67个转换位点和31个颠换位点。表明基nrDNAITS区序列分析可作为鉴定枸杞雄性不育材料的一种新的鉴别方法。但现有技术中，仍然存在枸杞优异资源挖掘和利用滞后、枸杞种质资源遗传背景不清、种间关系不明等问题，同时仍然缺乏针对不同地区、不同种质来源的多品种进行统一的快速鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中枸杞优异资源挖掘和利用滞后、枸杞种质资源遗传背景不清、种间关系不明、对于外在形态、习性、组织构造相近的枸杞种属无法区分等问题，特别针对于枸杞属的条形码数据库在物种丰富度及数量上都相对欠缺等问题，依托国内唯一的枸杞种质资源圃和在长期开展枸杞新品种选育获得的育种材料的基础上，同时提供了黑果枸杞、黄果枸杞、圆果枸杞、红枝枸杞等品种，宁夏枸杞地方品种、四川、北方、新疆、云南、河北等地方品种以及杂交群体、航天诱变群体、倍性群体等不同枸杞来源中具有代表性种质的枸杞的分子标记快速鉴定方法，可应用于枸杞种属的鉴定。本专利技术的目的是提供利用DNA条形码鉴定枸杞品种、确定枸杞种间关系的方法，同时在该方法基础上获得psbH-petB条形码数据库，通过将待鉴定样品的psbH-petB序列与所述psbH-petB条形码数据库中的序列进行比对，能够有效地对枸杞种属进行鉴定，并确定枸杞的种间关系，为枸杞品种提供有效的依据。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，所述DNA条形码为psbH-petB条形码。所述可鉴定的枸杞品种包括宁杞1号(L.barbarumLinn)、宁杞3号、宁杞4号、宁杞6号、宁农杞9号、黄果变枸杞(L.barbarumLinn.var.auranticarpumK.F.Chingvar.nov.)、扁果枸杞(LyciumbarbarumBianguo)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)、宁农杞5号(L.barbarumLinn)、北方枸杞(LyciumchinenseMilL.var.potaninii(Pojark.)A.M.Lu)、圆果枸杞、9001、宁夏黄果、四川枸杞(Lyciumchinense)、大麻叶枸杞(Damaye(L.barbarumLinn))、白花枸杞(Baihua(L.barbarum))中国枸杞(L.ChinenseMill.var.)、云南枸杞(LyciumyunnanenseKuangetA.M.Lu)、蔓生枸杞(Manshenggouqi(L.barbarum))、紫柄枸杞(Ziguogouqi(L.barbarum))、红枝枸杞(Lyciumdasystemum)、河北枸杞、昌吉枸杞、新疆枸杞(LyciumdasystemumPojark)等品种。优选地，所述基于DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，步骤如下：1)从枸杞样品中提取基因组DNA；2)以所述基因组DNA为模板，用如核苷酸序列SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示引物扩增psbH-petB条形码的序列片段，得到PCR产物；3)对所述PCR扩增产物进行测序；4)构建系统进化树，鉴定枸杞。本专利技术通过筛选获得的psbH-petB序列，通过同源性比对，进行对位排列，分析计算目标序列的碱基组成，序列间的碱基变异频率和序列间的转换颠换频率及其比率，比较序列种内和种间差异的分布，构建系统发育树，建立psbH-petBDNA条形码的鉴定技术体系，用于枸杞品种的鉴定。优选地，所述步骤1)中，样品基因组DNA采用试剂盒进行抽提。更优选地，所述步骤1)中，试剂盒为DNAsecurePlantKit。更优选地，所述采用试剂盒进行DNA抽提的步骤如下：(1)DNA的提取采集枸杞植株的鲜嫩叶片为枸杞样品，经洗涤，-80℃冻存，所述枸杞样品的总DNA的提取采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(DNAsecurePlantKit)提取；(2)DNA浓度与纯度检测将所述步骤(1)提取得到的DNA分别进行①琼脂糖凝胶电泳检测和②紫外分光光度计检测。优选地，所述步骤(1)中，试剂盒提取方法如下：①取100g样品于多功能高效生物样品制备仪研磨，22次/s，研磨2min。立刻加入400ul缓冲液LP1和6ulRNaseA(10mg/ml))，旋涡振荡1min，室温放置10min。②加入130ul缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。③12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。④加入1.5倍体积的缓冲液LP3，(使用前请先检査是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，其特征在于：所述DNA条形码为psbH-petB条形码。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，其特征在于：所述DNA条形码为psbH-petB条形码。


2.如权利要求1所述一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，其特征在于：步骤如下：
1)从枸杞样品中提取基因组DNA；
2)以所述基因组DNA为模板，用如核苷酸序列SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示引物扩增psbH-petB条形码的序列片段，得到PCR产物；
3)对所述PCR扩增产物进行测序；
4)构建系统进化树，鉴定枸杞。


3.如权利要求2所述一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，其特征在于：所述步骤1)中，样品基因组DNA采用试剂盒进行抽提。


4.如权利要求3所述一种利用DNA条形码鉴定枸杞品种的方法，其特征在于：所述步骤1)中，DNA的抽提步骤如下：
(1)DNA的提取
将所述枸杞样品经洗涤，-80℃冻存，并采用试剂盒(DNAsecurePlantKit)提取所述枸杞样品的总DNA；
(2)DNA浓度与纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：石志刚，万如，王秀英，张曦燕，李云翔，杨利斌，王孝，马婷慧，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：宁夏;64