一种激光致ＤＮＡ损伤的检测方法，包含如下步骤： （１）选择与纯化细胞 选择动植物细胞，常规方法制备，用ＰＢＳ悬浮细胞，得细胞悬液； 离心纯化； （２）调整细胞浓度 进行细胞计数，调最终细胞浓度至８×１０↑［５］～２×１０↑［６］个／ｍｌ，备用； （３）用激光处理细胞 将步骤（２）所述细胞分为五组依次记为：Ｃ、Ｌ↓［５］、Ｌ↓［１０］、Ｌ↓［１５］、Ｌ↓［２０］，Ｃ组为对照组，采用激光器，以１００～８００μＪ／ｃｍ↑［２］的能量密度对Ｌ↓［５］组照射５个脉冲，对Ｌ↓［１０］组照射１０个脉冲，对Ｌ↓［１５］组照射１５个脉冲，对Ｌ↓［２０］组照射２０个脉冲，备用； （４）检测激光致ＤＮＡ的损伤程度 １）预制盖玻片：将盖玻片放入酒精中浸泡１０ｍｉｎ后，备用； ２）预制载玻片：在普通载玻片上滴加６０～１２０μｌ ＮＭＡ即正常熔点琼脂糖凝胶，加盖预制的盖玻片，于４℃下放置５－１０ｍｉｎ，待ＮＭＡ冷凝后取下盖玻片，放入３７℃烘箱中３～１０ｍｉｎ，用砂纸垂直按压凝胶，至凝胶表面有砂粒孔止，再放入烘箱干燥３０～９０ｍｉｎ，至少预制五张载玻片，备用； ３）向步骤２）预制好的载玻片上各滴加８０～１２０μｌ ＮＭＡ，并加盖预制盖玻片，于４℃下放置５～１０ｍｉｎ，待ＮＭＡ冷凝后取下盖玻片，备用； ４）将２０～３０μｌ对照组Ｃ组细胞与６０～９０μｌ ＬＭＡ即低熔点琼脂糖凝胶混匀；取８０～１２０μｌ混合液铺于载玻片上并加盖盖玻片，于４℃下放置５～１０ｍｉｎ后取下盖玻片；然后在其上滴加８０～１２０μｌ ＮＭＡ并加盖盖玻片，于４℃下放置５～１０ｍｉｎ； Ｌ↓［５］～Ｌ↓［２０］组各组依同样的方法铺胶； ５）将步骤４）制备好的五组载玻片放入一平皿中，加入５０～１００ｍｌ裂解液，裂解液使用量不少于１０～１５ｍｌ／片，以覆盖过载玻片为准；裂解１．５～２ｈ； ６）取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓缓注入碱性电泳缓冲液，静置２０～４０ｍｉｎ后开始电泳，电流２００～２５０ｍＡ，电压１８～２５Ｖ，电泳时间为２０ｍｉｎ； ７）电泳结束后，将载玻片放入中和缓冲液中，中和两次，每次１０～２０ｍｉｎ；然后，向每个载玻片上滴加２０～３０μｌ浓度为１～２ｍｇ／ｍｌ的ＥＢ并加盖盖玻片，染色１０～２０ｍｉｎ； ８）荧光显微镜下观察实验结果，激发光波长为５４０ｎｍ； 阳性结果为黑色背景，红色带有拖尾的ＤＮＡ彗星图像； 阴性结果为黑色背景，红色圆点状ＤＮＡ图像； （５）ＤＮＡ损伤程度的分级 用ＣＡＳＰ软件分析阳性结果，根据拖尾中ＤＮＡ的量占细胞总ＤＮＡ的比例，以百分比计，ＤＮＡ损伤＜５％为０级，即正常细胞；ＤＮＡ损伤５％～２０％为１级，即低度损伤；ＤＮＡ损伤２０％～４０％为２级，即中度损伤；ＤＮＡ损伤４０％～９０％为３级，即高度损伤；ＤＮＡ损伤＞９５％为４级，即重度损伤。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种激光致ＤＮＡ损伤的检测方法，包含如下步骤：（１）选择与纯化细胞选择动植物细胞，常规方法制备，用ＰＢＳ悬浮细胞，得细胞悬液；离心纯化；（２）调整细胞浓度进行细胞计数，调最终细胞浓度至８×１０↑［５］～２×１０↑［６］个／ｍｌ，备用；（３）用激光处理细胞将步骤（２）所述细胞分为五组依次记为：Ｃ、Ｌ↓［５］、Ｌ↓［１０］、Ｌ↓［１５］、Ｌ↓［２０］，Ｃ组为对照组，采用激光器，以１００～８００μＪ／ｃｍ↑［２］的能量密度对Ｌ↓［５］组照射５个脉冲，对Ｌ↓［１０］组照射１０个脉冲，对Ｌ↓［１５］组照射１５个脉冲，对Ｌ↓［２０］组照射２０个脉冲，备用；（４）检测激光致ＤＮＡ的损伤程度１）预制盖玻片：将...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：时永香，张楠，吴克良，张乐，白增亮，张少军，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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