ROR2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失中的用途制造技术

本发明专利技术涉及抗ROR2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ROR2抑制剂及其在治疗和/或预防软骨缺失中的用途
本专利技术涉及软骨缺失(cartilageloss)的治疗和/或预防，该软骨缺失例如在骨关节炎、软骨缺损(chondraldefect)、骨软骨缺损或创伤中发生的软骨缺失。因此，本专利技术涉及骨关节炎的治疗，并且涉及骨关节炎中的一种或多种症状的改善。本专利技术还涉及促进软骨修复，例如，通过促进新的软骨生长和软骨分化和/或通过减少或预防软骨降解。本专利技术指向ROR2抑制剂的用途，且特别是抗ROR2抗体或靶向ROR2的siRNA在这些病症的治疗中的用途。本专利技术还涉及ROR2抑制剂在增强自体细胞制剂在体内产生软骨的能力的方法中的用途。本专利技术还涉及用于软骨缺失、骨关节炎、与骨关节炎相关的疼痛和/或软骨降解的诊断和预测方法，该方法涉及确定ROR2的表达水平和/或活性。
技术介绍
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种关节疾病，其特征是关节软骨破裂，关节软骨即这样的组织：覆盖长骨的末端从而允许无摩擦的关节运动和骨骼变化，包括使支撑软骨的骨骼增厚以及在关节边缘处的过度骨形成(骨赘)。OA影响多至1/3的45岁以上人群，是世界范围内慢性残疾的主要病因，并且耗费西方国家GDP的1％至2％。OA通常由病理性慢性机械损伤引起，病理性慢性机械损伤例如体重超重、关节错位、或关节不稳，例如韧带和半月板病变。炎症有时作为组织损伤的结果存在出现于在OA关节中但是并不驱使疾病发展，且事实上，缺少编码炎症细胞因子IL-6和IL-1或趋化因子受体CXCR2的基因的小鼠更容易患OA(Clementsetal.,2003；Hoogeetal.,2005；Sherwoodetal.,2013)。除了骨关节炎之外，软骨缺失也是炎性关节炎(例如类风湿性关节炎或银屑病关节炎)的失能结果。在这种情况下，即使我们采用当前的抗炎疗法来设法控制炎症，如果已经出现了软骨损伤，那么患者将仍会经历诸如关节痛和活动能力丧失的症状，并且，与炎症无关，由于最初的软骨缺失，在病理生物力学的驱使下，关节损伤将进一步发展。在所有关节镜手术的60％中发现了软骨缺损，这可能会有慢性疼痛并可能导致骨关节炎。当前的治疗方法仅导致像在微骨折的情况下的仅仅暂时的改善，或者像自体软骨细胞移植的情况，细胞产物的自体性质阻碍了扩大规模，这意味着复杂的手术，并使生产成本不适合常规应用。软骨再生治疗气管软化是可取的，其中，由于创伤或炎症，气管软骨塌陷从而阻碍了呼吸。在出现破坏耳朵或鼻子的创伤、烧伤或炎性状况后，软骨再生对重建该组织也可以是有用的。关节软骨是由软骨细胞组成的无血管组织，软骨细胞分泌大量的富含糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)的胞外基质，该胞外基质主要由蛋白聚糖Aggrecan和II型胶原蛋白组成。在静息状态下，软骨具有极低的更替率。然而，在受伤后，内平衡机制被调动，包括上调软骨转录因子SOX-9及其转录靶标COL2A1和ACAN(其编码软骨胞外基质II型胶原蛋白和Aggrecan的主要成分)。在有利的条件下，这种响应恢复软骨完整性并抵消有害的刺激(Buckwalteretal.,2004；Sherwoodetal.,2014)。如果受伤过于严重且是持续的(肥胖、创伤、错位)，或者如果因为遗传因素或年龄，内平衡响应是有缺陷的，则软骨缺失占上风并发展。进一步的软骨缺失是由胞外基质降解酶(例如基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMP)和聚蛋白多糖酶ADAMTS-4和ADAMTS-5)的活化介导的((NagaseandKashiwagi,2003；Glassonetal.,2005；Stantonetal.,2005)。许多触发这种对受伤的内平衡响应的信号在胚胎骨骼发育中也起着重要作用((Dell’Accioetal.,2008a；Sherwoodetal.,2014)。特别是WNT信号转导不仅对关节特化和发展必不可少(HartmannandTabin,2001；Guoetal.,2004)，而且通过有助于成骨分化且阻断成软骨分化来控制骨骼祖细胞的分化和命运(Hilletal.,2005)。WNT是一个具有19种多效性形态发生素的家族，在与其称为卷曲蛋白(Frizzled，FZD)的受体结合后，WNT通过以下多种通路发出信号：“经典”β连环蛋白依赖性通路(βcatenin-dependentpathway)，以及一些鲜为人知的“非经典”通路，“非经典”通路之一是涉及共受体ROR2的平面细胞极性(Planarcellpolarity，PCP)通路(Yamamotoetal.,2008；Gaoetal.,2011)。在经典通路中，“经典”WNT(例如WNT1)与FZD受体的接合导致FZD及其共受体LRP-5或LRP-6的二聚化、胞质β-连环蛋白的累积，然后胞质β-连环蛋白转移至细胞核，与TCF/LEF1转录因子结合，并激活靶标基因的转录。在WNTPCP通路中，通过“非经典”WNT(例如WNT-5A)的FZD接合导致与共受体ROR2(酪氨酸激酶受体)的异源二聚化、细胞内的分子Vangl2的磷酸化以及与由经典WNT信号转导驱动的那些事件不同的下游事件(Gaoetal.,2011)。WNT信号转导在软骨中起着双重作用。在成人软骨中，最表层的细胞层由祖细胞组成，该祖细胞在整个生命中都提供软骨细胞(Kozhemyakinaetal.,2015)。经典WNT信号转导通过预防其早熟的软骨细胞的分化来维持该祖细胞群((Deckeretal.,2014)。然而，在成熟的软骨细胞中，典型WNT信号转导促进了一种称为软骨细胞肥大(chondrocytehypertrophy)的终末分化的形式(Enomoto-Iwamotoetal.,2002)。在骨骼发育过程中，软骨细胞肥大先于软骨钙化且最后被骨骼取代。在生理条件下，关节软骨细胞对肥大具有抵抗力。在OA期间，机械损伤触发了异位软骨细胞肥大，进而驱使软骨破裂和OA发展((Saitoetal.,2010；Yangetal.,2010)。依此进行，与经典WNT激活增加相关的等位基因变体与发展OA的风险较高相关(Loughlinetal.,2004；Loriesetal.,2006；Kerkhofetal.,2008；Luytenetal.,2009；Betancourtetal.,2012)。由于WNT信号转导的这种双重作用(一个好处：维持必要的祖细胞群和一种病理)，迄今为止，靶向OA中的经典WNT信号转导一直令人失望。对由ROR2介导的WNTPCP通路在骨骼生物学中的作用研究较少。在胚胎发育过程中，Ror2主要在包括肋骨前部和预期关节软骨的永久性软骨中表达，但也在生长板和其他器官(例如真皮和胚胎端脑)中表达(DeChiaraetal.,2000；Al-shawietal.,2001)。发育过程中ROR2的缺失导致长骨较短以及软骨钙化、软骨肥大和软骨内骨形成的延迟(DeChiaraetal.,2000)。在人类中，ROR2的缺失导致Robinow综合征(Rob本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗和/或预防软骨缺失、治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的用途的ROR2抑制剂，其中所述ROR2抑制剂选自由针对ROR2的寡核苷酸、抗ROR2抗体或其片段、ROR2蛋白的可溶性片段组成的组。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171116 GB 1718985.31.一种用于治疗和/或预防软骨缺失、治疗和/或预防骨关节炎、治疗和/或预防与骨关节炎相关的疼痛、促进软骨修复、和/或预防软骨降解的用途的ROR2抑制剂，其中所述ROR2抑制剂选自由针对ROR2的寡核苷酸、抗ROR2抗体或其片段、ROR2蛋白的可溶性片段组成的组。


2.根据权利要求1所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是单链的或双链的。


3.根据权利要求1或2所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸包括DNA或RNA。


4.根据权利要求3所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是短干扰RNA(siRNA)。


5.根据权利要求3所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是双链RNA(dsRNA)。


6.根据权利要求3所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是短发夹RNA(shRNA)。


7.根据权利要求6所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述shRNA包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：
(i)5'GGUUCACGACUGCGAAUCCAGGACCUGGA3’(SEQIDNO:15)，包含SEQIDNO:15的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(ii)5'AAGACCAUUACCGCCACUGGCGUCCUGUU3’(SEQIDNO:16)，包含SEQIDNO:16的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(iii)5'AUGGAUUACAGAGGAACGGCAAGCACCAC3’(SEQIDNO:17)，包含SEQIDNO:17的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(iv)5'AAGCAGAAGGCAUCUGCGUCCACACCGCA3’(SEQIDNO:18)，包含SEQIDNO:18的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(v)5'CCUUGAGCAUGAUCUUCAGCUACUGUUCC3’(SEQIDNO:19)，包含SEQIDNO:19的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及
(vi)与SEQIDNO:15-19中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含SEQIDNO:15-19中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。


8.根据权利要求3所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸为微RNA(miRNA)。


9.根据权利要求3所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是包含向导序列的向导RNA，所述向导序列与内源性ROR2基因内的位点杂交并使CRISPR-Cas酶靶标向于所述位点。


10.根据前述权利要求中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸的长度为10-35个核苷酸。


11.根据前述权利要求中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述寡核苷酸是反义寡核苷酸(AON)。


12.根据权利要求4所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
(i)5'AAGUCUACAAAGGUCACCUGU3’(SEQIDNO:包含SEQIDNO:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(iii)5'AAGUCUACAAAGGUCACCUGUCCUGUCUC3’(SEQIDNO:2)，包含SEQIDNO:2的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(iii)5'AAACAGGUGACCUUUGUAGAC3’(SEQIDNO:3)，包含SEQIDNO:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；
(iv)5'AAACAGGUGACCUGUAGACCCUGUCUC3’(SEQIDNO:4)，包含SEQIDNO:4的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；以及
(vi)与SEQIDNO:1-4中的任一个序列互补的核苷酸序列，与包含SEQIDNO:1-4中的至少10个连续核苷酸的片段互补的核苷酸序列，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。


13.根据权利要求4或11所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述siRNA包括序列：
(i)5'AAGUCUACAAAGGUCACCUGU3’(SEQIDNO:1)，包含SEQIDNO:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体；和/或
(ii)5'AAACAGGUGACCUUUGUAGAC3’(SEQIDNO:3)，包含SEQIDNO:3的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体。


14.根据权利要求4、12和13中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述siRNA与运载体缀合或被封装在胞外囊泡、脂质体或树状聚合物内。


15.根据权利要求14所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述运载体选自由去端肽胶原、诸如胆固醇的脂质、生物聚合物、以及诸如金纳米颗粒的金属纳米颗粒组成的组。


16.根据权利要求1所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述抗ROR2抗体是阻断抗体。


17.根据权利要求1或16所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述抗ROR2抗体是：(a)完整的抗ROR2抗体；或(b)选自由以下组成的组的抗ROR2抗体的片段：
(i)Fv片段，可选地其中所述Fv片段是单链Fv片段或二硫键键合的Fv片段；和
(ii)Fab片段；可选地其中Fab样片段是Fab′片段或F(ab′)2片段。


18.根据权利要求1、16和17中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述抗ROR2抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。


19.根据权利要求1和16-18中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述抗ROR2抗体是单克隆抗体。


20.根据权利要求1所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，ROR2蛋白的可溶性片段包括ROR2蛋白的胞外结构域的全部或一部分。


21.根据权利要求20所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述ROR2蛋白的可溶性片段还包括膜锚。


22.根据权利要求21所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述膜锚连接至所述胞外结构域的C端。


23.根据权利要求21或22所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述膜锚通过接头连接至所述胞外结构域。


24.根据权利要求21-23中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述膜锚是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。


25.根据权利要求20-24中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述ROR2蛋白的所述可溶性片段还包括亲和标签。


26.根据权利要求25所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述亲和标签在所述胞外结构域或所述膜锚的C端。


27.根据权利要求25或26所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述亲和标签选自由以下组成的组：Myc/His标签、Myc标签、His标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、StrepII标签、FLAG标签、碱性磷酸酶标签、噬菌体T7表位标签(T7标签)、钙调蛋白结合肽(CBP)标签、半乳糖结合蛋白(GBP)标签、人流感血凝素(HA)标签及其组合。


28.根据权利要求25-27中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述ROR2蛋白的所述可溶性片段还包括切割标签，所述切割标签布置为允许从所述ROR2蛋白的所述可溶性片段中切割所述亲和标签。


29.根据权利要求28所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述切割标签在所述胞外结构域或所述膜锚的C端并且在所述亲和标签的N端。


30.根据权利要求28或29所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述切割标签选自由以下组成的组：肠激酶切割标签、烟草蚀刻病毒蛋白酶切割位点、凝血酶切割标签、Xa因子(FXa)切割标签、人鼻病毒(HRV)3C蛋白酶(“PreScission”)切割标签及其组合。


31.根据权利要求20-30中任一项所述的用途的ROR2抑制剂，其特征在于，所述胞外结构域包括与SEQIDNO:10具有至少50％同一性的多肽。


32.一种如权利要求20-31中任一项所定义的ROR2抑制剂。


33.一种针对ROR2的短干扰RNA(siRNA)，其中所述siRNA包含选自由以下组成的组的序列：
(i)5'AAGUCUACAAAGGUCACCUGU3’(SEQIDNO:1)，包含SEQIDNO:1的至少10个连续核苷酸的片段，及其具有多达三个核苷酸替代的变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗西斯科·德里阿斯科，安妮苏菲·索鲁普，
申请(专利权)人：伦敦玛丽王后大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB