分子诊断酶制剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种分子诊断酶制剂的制备方法，包括以下步骤：1)构建表达菌株：1‑1)克隆选择的表达基因的核酸序列；1‑2)构建重组质粒；1‑3)获得重组表达菌株；2)重组表达菌株进行目的蛋白表达；3)目的蛋白纯化。本发明专利技术的分子诊断酶制剂的制备方法可获得高纯度DNA聚合酶，不仅可用于普通的PCR反应，在对反应条件要求较高的荧光定量PCR及数字PCR反应也可以有效使用；本发明专利技术中的纯化方法可以应用到所有耐热DNA聚合酶的纯化流程，能减少相关实验的操作难度，且可以为工业化大规模生产提供借鉴和帮助；本发明专利技术获得的酶可在‑20℃下稳定保存1年以上，具有良好的产品开发潜质。

【技术实现步骤摘要】
分子诊断酶制剂的制备方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种分子诊断酶制剂的制备方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)是80年代中期提出的体外核酸扩增技术，得益于TaqDNA聚合酶的发现及基因工程的发展，PCR反应的核心-DNA聚合酶得以大批量的生产，促进了以PCR技术为核心的一系列相关检测技术的发现和进步，随着研究的进一步发展，更多地耐热DNA聚合酶被发现和应用，其中从激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)中分离的PfuDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性，可以在催化聚合反应的同时,纠正聚合反应过程中错误掺入的碱基，具有高保真的DNA聚合活性,极大的促进了基因工程的发展。紧接着，KODDNA聚合酶从日本的Kodakara岛的solfatarichotspring分离而得的嗜热古柯氏柯达氏球菌(HyperthermophilicarchaeaThermococcuskodakaraensisKOD1)筛选出来。相对于TaqDNA聚合酶和PfuD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分子诊断酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)构建表达菌株：/n1-1)克隆选择的表达基因的核酸序列，该核酸序列的3′段引物带有6个His密码子；/n1-2)构建重组质粒；/n1-3)获得重组表达菌株；/n2)重组表达菌株进行目的蛋白表达；/n3)目的蛋白纯化：/n3-1)收集步骤2)获得的菌株，洗涤；/n3-2)将洗涤后的菌体重悬，破碎；/n3-3)无需离心，直接将破碎后的具体进行热纯化，再离心取上清液；/n3-4)将上清液进行Ni柱纯化，收集目的蛋白洗脱液；/n3-5)目的蛋白洗脱液浓缩，获得目的酶制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种分子诊断酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建表达菌株：
1-1)克隆选择的表达基因的核酸序列，该核酸序列的3′段引物带有6个His密码子；
1-2)构建重组质粒；
1-3)获得重组表达菌株；
2)重组表达菌株进行目的蛋白表达；
3)目的蛋白纯化：
3-1)收集步骤2)获得的菌株，洗涤；
3-2)将洗涤后的菌体重悬，破碎；
3-3)无需离心，直接将破碎后的具体进行热纯化，再离心取上清液；
3-4)将上清液进行Ni柱纯化，收集目的蛋白洗脱液；
3-5)目的蛋白洗脱液浓缩，获得目的酶制剂。


2.根据权利要求1所述的分子诊断酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)克隆SEQIDNo.1所示的核酸序列，其中3′段引物带有6个His密码子；
引物对为：
正向引物F-KOD：GGAATTCCATATGATCCTCGACACTGA；
反向引物R-KOD：



以上引物中，斜体加粗部分为His密码子，正向引物中下划线部分为NdeI酶切位点，反向引物中下划线部分为BamHI酶切位点；
1-2)将1-1)中所得的核苷酸片段和质粒pET-22b连接，构成重组质粒pET-22b-KOD；
1-3)将1-2)中所得的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经菌落PCR验证，获得重组表达菌株。


3.根据权利要求2所述的分子诊断酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
将获得的重组表达菌株在LB培养基中培养，37℃、150rpm，培养至OD600＝0.4～0.8，添加诱导剂IPTG0.2～1mM，在16～37℃下150rpm诱导一段时间。


4.根据权利要求3所述的分子诊断酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，培养至OD600＝0.6，然后添加诱导剂IPTG0.2mM，在35℃、150rpm下诱导过夜。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹焕才，蔺春茂，殷建，
申请(专利权)人：济南国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37