一种改性热启动酶及其制备方法技术

本申请属于生物技术领域，具体为一种改性热启动酶及其制备方法，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1‑2h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于5℃下机械搅拌3‑4min，后置于高压下5‑6min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于3‑4℃下静置15‑16min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。

【技术实现步骤摘要】
一种改性热启动酶及其制备方法
本申请属于生物
，具体为一种改性热启动酶及其制备方法。
技术介绍
聚合酶链反应，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链反应技术被广泛地应用在医学和生物学的实验室，如亲子鉴定等。热启动是在聚合酶链反应(PCR)中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式。目前，因为活性蛋白容易变性失活因而纯化都是在低温下进行，需要反复经过沉淀、层析等工艺进行纯化，不仅耗时长、纯度低，而且在提取过程中就有部分热启动酶失活。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本申请提供了一种热启动酶及其制备方法，本申请是通过下述方案实现的：一种改性热启动酶及其制备方法，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1-2h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于5℃下机械搅拌3-4min，后置于高压下5-6min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于3-4℃下静置15-16min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。优选的，所述步骤(1)所述机械破碎为利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将菌体破碎，转速为12000-13000r/min。优选的，所述步骤(2)所述的高压为35-36MPa，将菌体置于高压容器中，打开高压容器的阀门，菌体经过阀门流出，流出速度为15-20ml/min；所述溶菌酶与菌体的质量比为1:1。优选的，所述步骤(3)中含有热启动酶的清液和抽提剂的体积比为1:2；所述抽提剂、聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁的质量比为50-60:2:12:3。优选的，所述步骤(3)所述的抽提剂为离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂。优选的，所述离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂的体积比为3:15:2:5:1:1:6。优选的，所述离子强度调节剂为0.10-0.20的NaCl溶液。优选的，所述蛋白酶抑制剂为PMSF苯甲磺酰胺氯。优选的，所述防氧化剂为疏基乙醇；所述重金属络合剂为柠檬酸。如优选的，所述增溶剂为去氧胆酸钠。有益效果：与现有技术相比，本申请生产工艺简单，耗时短，效率高，所有的工艺都在低温下进行，减少了热启动酶的失活率；通过本申请制备的热启动酶纯度好，后期的基因扩增效果良好。附图说明图1实施例1热启动酶的电泳图；图2对比例1热启动酶的电泳图；具体实施方案为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。实施例1一种改性热启动酶及其制备方法，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1.3h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于5℃下机械搅拌3min，后置于高压下5min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于3℃下静置15min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。优选的，所述步骤(1)所述机械破碎为利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将菌体破碎，转速为12000r/min。优选的，所述步骤(2)所述的高压为35MPa，将菌体置于高压容器中，打开高压容器的阀门，菌体经过阀门流出，流出速度为15ml/min；所述溶菌酶与菌体的质量比为1:1。优选的，所述步骤(3)中含有热启动酶的清液和抽提剂的体积比为1:2；所述抽提剂、聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁的质量比为50:2:12:3。优选的，所述步骤(3)所述的抽提剂为离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂。优选的，所述离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂的体积比为3:15:2:5:1:1:6。优选的，所述离子强度调节剂为0.10的NaCl溶液。优选的，所述蛋白酶抑制剂为PMSF苯甲磺酰胺氯。优选的，所述防氧化剂为疏基乙醇；所述重金属络合剂为柠檬酸。优选的，所述增溶剂为去氧胆酸钠。热启动酶的纯度为98.97％。实施例2一种改性热启动酶及其制备方法，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1.8h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于6℃下机械搅拌4min，后置于高压下6min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于4℃下静置16min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。优选的，所述步骤(1)所述机械破碎为利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将菌体破碎，转速为13000r/min。优选的，所述步骤(2)所述的高压为36MPa，将菌体置于高压容器中，打开高压容器的阀门，菌体经过阀门流出，流出速度为20ml/min；所述溶菌酶与菌体的质量比为1:1。优选的，所述步骤(3)中含有热启动酶的清液和抽提剂的体积比为1:2；所述抽提剂、聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁的质量比为60:2:12:3。优选的，所述步骤(3)所述的抽提剂为离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂。优选的，所述离子强度调节剂、甘油、二甲亚砜、蛋白酶抑制剂、防氧化剂、重金属络合剂和增溶剂的体积比为3:15:2:5:1:1:6。优选的，所述离子强度调节剂为0.20的NaCl溶液。优选的，所述蛋白酶抑制剂为PMSF苯甲磺酰胺氯。优选的，所述防氧化剂为疏基乙醇；所述重金属络合剂为柠檬酸。优选的，所述增溶剂为去氧胆酸钠。热启动酶的纯度为98.12％。对比例1一种改性热启动酶及其制备方法，制备步骤如下：(1)将热启本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改性热启动酶及其制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1-2h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于5-6℃下机械搅拌3-4min，后置于高压下5-6min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于3-4℃下静置15-16min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。/n

【技术特征摘要】
1.一种改性热启动酶及其制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)将热启动酶菌体置于缓冲液中于室温下静置1-2h，后机械破碎；(2)向步骤(1)所得的缓冲液中加入溶菌酶，并于5-6℃下机械搅拌3-4min，后置于高压下5-6min，之后离心即得含有热启动酶的清液；(3)将步骤(2)中所得的含有热启动酶的清液和抽提剂混合均匀，于3-4℃下静置15-16min，向含有启动酶的清液和抽提剂的混合液中加入聚乙烯亚安胺、醋酸铅、单宁，混合均匀，静置，除去沉淀得滤液；(4)滤液经过膜分离技术分离出热启动酶；(5)所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白在45℃下反应1h得改性热启动酶，所述热启动酶、壳寡糖、鸡蛋清蛋白的质量比为4:4:7。


2.如权利要求1所述的一种热启动酶及其制备方法，其特征在于，所述步骤(1)所述机械破碎为利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将菌体破碎，转速为12000-13000r/min。


3.如权利要求1所述的一种改性热启动酶及其制备方法，其特征在于，所述步骤(2)所述的高压为35-36MPa，将菌体置于高压容器中，打开高压容器的阀门，菌体经过阀门流出，流出速度为15-20ml/min；所述溶菌酶与菌体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37