具有改进的精确度的DPO4聚合酶变体制造技术

提供了重组DPO4型DNA聚合酶变体，其具有赋予所述聚合酶以改良的特性的氨基酸取代，以用于改进的单分子测序应用。此类特性可以包括增强的结合和在子链中精确掺入大核苷酸类似物底物等。还提供了包含此类DPO4变体和核苷酸类似物的组合物，以及编码具有上述表型的聚合酶的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的精确度的DPO4聚合酶变体关于序列表的申明与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为870225_421WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为100KB，创建于2018年12月8日，并经由EFS-Web电子提交。
本公开总体上涉及聚合酶组合物和方法。更特别地，本公开涉及改良的DPO4聚合酶及其在生物和生物分子应用中的用途，包括例如高精度的核苷酸类似物掺入、引物延伸和单分子测序系统。
技术介绍
DNA聚合酶复制生物体的基因组。除了在生物学中的该主要作用外，DNA聚合酶也是生物技术的普遍工具。它们被广泛地用于例如反转录、扩增、标记和测序，其均为用于各种应用的主要技术，如核酸测序、核酸扩增、克隆、蛋白质工程、诊断、分子医学和许多其他技术。由于其重要性，已经对DNA聚合酶进行了广泛的研究，重点是例如聚合酶之间的系统发育关系、聚合酶的结构、聚合酶的结构-功能特征，以及聚合酶在DNA复制和其他基本生物学过程中的作用，以及在生物技术中使用DNA聚合酶的方式。科学家已经对来自所有三个生命界的DNA聚合酶进行了全面分类，其中酶根据其序列同源性分为六个主要家族(A、B、C、D、X和Y)。对于聚合酶的综述，参见，例如Hubscheretal.(2002)"EukaryoticDNAPolymerases"AnnualReviewofBiochemistryVol.71:133-163；Alba(2001)"ProteinFamilyReview:ReplicativeDNAPolymerases"GenomeBiology2(1):reviews3002.1-3002.4；Steitz(1999)"DNAPolymerases:structuraldiversityandcommonmechanisms"JBiolChem274:17395-17398，和Burgersetal.(2001)"EukaryoticDNAPolymerases:proposalforarevisednomenclature"JBiol.Chem.276(47):43487-90。许多聚合酶的晶体结构已被解决，它们通常共有相似的结构。已经确定了许多聚合酶的基本作用机理。DNA聚合酶的基本应用是在DNA测序技术中。从经典的Sanger测序方法到最新的“下一代”测序(NGS)技术，用于测序的核苷酸底物必然会随着时间而改变。这些快速变化的技术所需要的核苷酸修饰系列为DNA聚合酶研究人员引入了艰巨的任务，以为不断变化的DNA测序化学寻找、设计或发展相容性酶。已经鉴定出具有多种有用特性的DNA聚合酶突变体，包括相对于野生型对应酶而言改变的核苷酸类似物掺入能力。例如，VentA488LDNA聚合酶可以以比天然VentDNA聚合酶更高的效率掺入某些非标准核苷酸。参见Gardneretal.(2004)"ComparativeKineticsofNucleotideAnalogIncorporationbyVentDNAPolymerase"J.Biol.Chem.279(12):11834-11842，以及Gardner和Jack(1999)"DeterminantsofnucleotidesugarrecognitioninanarchaeonDNAPolymerase"NucleicAcidsResearch27(12):2545-2553。预测该突变体A488中改变的残基背对酶的核苷酸结合位点。在该位置处的松弛特异性模式与被取代的氨基酸侧链的大小大致相关，并通过多种改性的核苷酸糖的酶影响掺入。最近，NGS技术提出了调整DNA聚合酶的需求，以接受在3’-OH(如-ONH2)上以可逆的终止子修饰的核苷酸底物。为此，Chen和同事将结构分析与“重构的进化适应路径”分析相结合，以生成TAQL616A变体，其能够有效地掺入可逆的和不可逆的终止子。参见Chenetal.(2010)“ReconstructedEvolutionaryAdaptivePathsGivePolymerasesAcceptingReversibleTerminatorsforSequencingandSNPDetection”Proc.Nat.Acad.Sci.107(5):1948-1953。建模研究表明，该变体可能会在Phe-667后面开放空间，使其能够容纳较大的3’取代基。Emigetal.的第8,999,676号美国专利公开了显示改进的特性的另外的改良的聚合酶，其可用于基于荧光检测的单分子测序技术。特别地，发现DNA聚合酶在位置E375和K512处的取代增强了聚合酶利用掺入不同荧光染料的非天然的、磷酸盐标记的核苷酸类似物的能力。最近，Kokorisetal.已经描述了一种称为“扩展测序”(SBX)的方法，其使用DNA聚合酶将DNA的序列转录到称为Xpandomer的可测量的聚合物上(参见例如，Kokorisetal.的第8,324,360号美国专利)。转录的序列沿高信噪比报告子中的pandomer骨架编码，所述报告子隔开～10nm，且被设计为当被基于纳米孔的测序系统读取时具有高信噪比、高分化响应。Xpandomers是由被称为XNTP的非天然核苷酸类似物产生的，其特征是具有大的取代基，这些取代基使Xpandomer主链在合成后得以扩展。这样的XNTP类似物对当前可用的DNA聚合酶作为底物引入了新的挑战。Kokorisetal.的公开的WO2017/087281号PCT申请(通过引用整体并入本文)描述了利用非天然的大核苷酸类似物作为底物的具有增强的引物延伸活性的改造的DPO4聚合酶变体。DNA聚合酶面临的其他挑战是由模板中的某些核苷酸序列基序提出的。特别重要的是可触发滑链错配或“复制滑移”的均聚物或短重复DNA序列的运行。复制滑移被认为包括以下步骤：(i)通过复制机构复制第一重复序列，(ii)复制暂停和从新合成的末端离解聚合酶，(iii)新合成的链的不配对及其与第二重复序列的配对，以及(iv)恢复DNA合成。因此，复制机构在重复区域内的中止导致引物和模板未对准。在体内，两条DNA链在复制过程中未对准可导致DNA重排，如不同长度的缺失或重复。在体外，复制滑移会在滑移事件的位置处导致复制错误。聚合酶精确度的这种降低显著损害了特定的应用或所需的遗传操作。因此，可用于扩展测序(SBX)以及生物技术和生物医学中的其他应用(例如DNA扩增、常规测序、标记、检测、克隆等)的新的改良的聚合酶，例如为改进特性而设计的聚合酶，将在本领域中作为新型试剂而具有价值。本专利技术提供了具有这种期望特性的新的重组DNA聚合酶，包括能够以改进的效率掺入具有大取代基的核苷酸类似物，同时显示复制错误发生减少，即复制精确度增加。还提供了制备和使用这种聚合酶的方法，以及许多其他特征，这些特征在全面阅读下文后将变得显而易见。专利技术概述重组DNA聚合酶和改良的DNA聚合酶，例如改良的古细菌D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的重组DNA聚合酶，所述重组DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-340具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述重组聚合酶包含在氨基酸位置78处的突变以及选自31、36、62、63、79、243、252、253、254、331、332、334和338的氨基酸位置处的至少一个突变，其中所述氨基酸位置78处的突变是K78D，其中位置的识别为相对于野生型DPO4聚合酶(SEQID NO:1)，并且所述重组DNA聚合酶显示聚合酶活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171211 US 62/597,109;20180412 US 62/656,6961.分离的重组DNA聚合酶，所述重组DNA聚合酶包含与SEQIDNO:1的氨基酸1-340具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述重组聚合酶包含在氨基酸位置78处的突变以及选自31、36、62、63、79、243、252、253、254、331、332、334和338的氨基酸位置处的至少一个突变，其中所述氨基酸位置78处的突变是K78D，其中位置的识别为相对于野生型DPO4聚合酶(SEQIDNO:1)，并且所述重组DNA聚合酶显示聚合酶活性。


2.如权利要求1所述的聚合酶，其中所述聚合酶包含与SEQIDNO:1的氨基酸1-340具有至少85％同一性的氨基酸序列。


3.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置31处的突变是C31S。


4.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置36处的突变是R36K。


5.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置62处的突变是V62K。


6.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置63处的突变是E63R。


7.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置79处的突变选自：E79L、E79D和E79I。


8.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置243处的突变是K243R。


9.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置252处的突变选自：K252D、K252Q和K252R。


10.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置253处的突变是R253Q。


11.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置254处的突变是N254K或N254D。


12.如权利要求1或2所述的聚合酶，其中氨基酸位置331处的突变选自：R331D、R331E、R331N和R331L。


13.如权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·可可里斯，马克·普林德，格雷戈里·斯科特·蒂森，亚历山大·艾萨克·莱曼，德鲁·古德曼，亚伦·雅各布斯，约翰·查瑟，
申请(专利权)人：斯特拉托斯基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US