用于生物纳米孔的组装的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了用于制造和使用基于一种或多种天然生物纳米孔的检测装置的方法和组合物。使用包括但不限于核酸的检测和测序。本发明专利技术总体上涉及用于制备基于蛋白质的纳米孔传感器的新的方法和组合物，更具体地，涉及在脂质纳米盘中组装天然纳米孔蛋白质的方法，所述脂质纳米盘用作载体以将所述纳米孔递送至传感器系统的脂质膜组分，以及涉及使用它们特别是在基于纳米孔的核酸测序方法中使用它们的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物纳米孔的组装的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2019年10月30日提交的美国临时专利申请号62/928,207的权益；其中该临时申请出于所有目的以引用方式整体并入本文。


[0003]本专利技术总体上涉及用于制备基于蛋白质的纳米孔传感器的新的方法和组合物，更具体地，涉及在脂质纳米盘中组装天然纳米孔蛋白质的方法，该脂质纳米盘用作载体以将纳米孔递送至传感器系统的脂质膜组分，以及涉及使用它们特别是在基于纳米孔的核酸测序方法中使用它们的方法。

技术介绍

[0004]在过去二十年里，纳米孔传感器已经成为一种强大的工具，并对科学和生物技术产生了巨大的影响。纳米孔技术通常按其材料分为生物纳米孔和固态纳米孔。传统地，固态纳米孔是通过使用半导体或微流体技术，如硅或石墨烯基膜(诸如Si、SiN或SiO2)中的离子或电子束雕刻)钻出纳米级的孔来制造的。然而，大多数纳米孔应用(诸如DNA测序、小分子传感、药物筛选、分子筛分和生物分子分析)都需要高精度的几何结构、灵敏度和重现性，而这些是固态孔无法实现的。
[0005]DNA测序是纳米孔最重要和期望最高的应用。然而，DNA通过纳米孔的易位速度非常快(多个核苷酸在几微秒内通过纳米孔)，与之相关的主要问题导致每个碱基的数据点很少，这阻碍了数据的进一步分析。为了解决此类问题，Stratos Genomics开发了一种称为扩展测序(“SBX”)的方法，该方法使用生化过程将DNA序列转录到称为“Xpandomer”的可测量聚合物上(参见例如Kokoris et al.，U.S.Pat.No.7,939,259，
″
High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion
″
)。转录的序列沿Xpandomer主链在高信噪比报告子中编码，所述报告子相隔约10nm，专为高信噪比、分化良好的反应而设计。这些差异在Xpandomer相对于天然DNA的序列读段效率和准确性方面提供了显著的性能增强。Xpandomer可以实现多种下一代DNA测序检测技术，并且非常适合纳米孔测序。
[0006]α
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溶血素(α
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HL)是用于单分子分析的最广泛使用的生物纳米孔，主要是由于其小内径和结构重现性。α
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HL是一种单体多肽，在脂质双层膜中自组装以形成跨膜七聚孔，其具有2.6nm直径的前庭和1.5nm直径的极限孔径(孔的最窄点)。α
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HL纳米孔的极限孔径允许尺寸与单链DNA属于同一量级的线性分子通过或“易位”；然而，直径大于约2.0nm的分子，例如双链DNA，则被阻止易位。尽管α
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HL(以及其它寡聚、跨膜蛋白质纳米孔)在DNA测序中具有优势，但其仍然具有固有的结构限制，例如，由于天然寡聚体在水溶液中的稳定性降低以及天然蛋白质在脂质膜中的组装不完全，从而需要改进的方法和组合物来制备生物纳米孔传感器。
[0007]本专利技术满足这些需要并提供如下所述的进一步的相关改进优点。
[0008]背景部分中讨论的所有主题都不一定是现有技术，不应仅仅因为其在背景部分中
的讨论而被假定为现有技术。沿着这些思路，除非明确说明是现有技术，否则对背景部分中讨论的或与此类主题相关的现有技术中的问题的任何认识不应被视为现有技术。相反，背景部分中对任何主题的讨论都应被视为专利技术人解决特定问题的方法的一部分，其本身也可能具有创造性。

技术实现思路

[0009]一个或多个实施例的细节在附图和以下说明书中阐述。其他特征、目的和优点将从说明书与附图以及权利要求中显而易见。
[0010]简而言之，本公开提供了用于改进制造基于纳米孔的传感器的方法和组合物。在特定实施例中，该方法和组合物能够利用天然纳米孔结构的改进的同化作用制造基于生物纳米孔的传感器。
[0011]在一个方面，本专利技术提供一种制备包括一种或多种天然纳米孔蛋白质的检测装置的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包括纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物，以产生一种纳米盘
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纳米孔蛋白复合物的样品，其中样品中的纳米盘
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纳米孔蛋白复合物的群体各自包括天然纳米孔蛋白质；(b)提供包括一个或多个孔口的固相支持体，其中在该孔口中的每一个孔口之上形成膜，其中该膜包括第二脂质，并且其中该膜在检测装置中将顺式腔室与反式腔室分隔；(c)以及将一个或多个膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化到这些膜中的每一个膜中。在一个实施例中，该方法进一步包括在将一个或多个膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从水性混合物中纯化包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体的步骤。在进一步的实施例中，包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体的纯化步骤包括尺寸排阻色谱和亲和色谱中的一者或两者。在另一个实施例中，水性混合物进一步包括洗涤剂，其中洗涤剂的最终浓度为约14mM至约40mM。在一个进一步的实施例中，第一脂质为1，2
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二植烷酰基
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sn
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甘油
‑3‑
磷酸胆碱(DPhPC)，MSP为MSP1D1或其变体，纳米孔蛋白质为α
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溶血素(α
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HL)或其变体，洗涤剂为胆酸盐，并且第二脂质为1，2
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二植烷酰基
‑
sn
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甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺(DPhPE)。在又一个进一步的实施例中，脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。在另一个实施例中，固相支持体包括多个孔口，其中在该多个孔口中的每一个孔口之上形成膜，并且将其中这些膜中的每一个膜与包含天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物接触。
[0012]在另一个方面，本专利技术提供了一种对聚合物测序的方法，该方法包括使上述检测装置中任意装置的使用。在某些实施例中，聚合物是Xpandomer。
[0013]在另一个方面，本专利技术提供一种在膜中形成天然纳米孔蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包括纳米孔蛋白、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物，以产生一种纳米盘
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纳米孔蛋白复合物的样品，其中纳米盘
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纳米孔蛋白复合物的群体各自包括天然纳米孔蛋白质；(b)提供包括第二脂质的膜；(c)将膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化膜。在一个实施例中，该方法进一步包括在将膜与包括天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备包含一种或多种天然纳米孔蛋白质的检测装置的方法，所述方法包括以下步骤：(a)形成包含纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物以产生纳米盘
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纳米孔蛋白质复合物的样品，其中所述样品中的所述纳米盘
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纳米孔蛋白质复合物的群体各自包含天然纳米孔蛋白质；(b)提供包含一个或多个孔口的固体支持物，其中在所述孔口中的每一个孔口之上形成膜，其中所述膜包含第二脂质，并且其中所述膜在所述检测装置中将顺式腔室与反式腔室分隔；以及(c)将一个或多个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化到所述膜中的每一个膜中。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在将所述一个或多个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触的步骤之前，从所述水性混合物中纯化包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔
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纳米盘复合物的群体的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中纯化包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔
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纳米盘复合物的群体的所述步骤包含尺寸排阻色谱和亲和色谱中的一者或两者。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性混合物进一步包含洗涤剂，其中所述洗涤剂的最终浓度为约14mM至约40mM。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一脂质为1，2
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二植烷酰基
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sn
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甘油
‑3‑
磷酸胆碱(DPhPC)，所述MSP为MSP1D1或其变体，所述纳米孔蛋白质为α
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溶血素(α
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HL)或其变体，所述洗涤剂为胆酸盐，并且所述第二脂质为1，2
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二植烷酰基
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sn
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甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺(DPhPE)。6.根据权利要求5所述的方法，其中脂质与MSP与纳米孔蛋白质的摩尔比为约101∶6∶1或约120∶6∶1。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包含多个孔口，其中在所述多个孔口中的每一个孔口之上形成膜，并且其中所述膜中的每一个膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的所述纳米孔
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纳米盘复合物接触。8.一种对聚合物测序的方法，所述方法包括使用根据权利要求1至7中任一项所述的检测系统。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合物为Xpandomer。10.一种在膜中形成天然纳米孔蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)形成包含纳米孔蛋白质、膜支架蛋白质(MSP)和第一脂质的水性混合物以产生纳米盘
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纳米孔蛋白质复合物的样品，其中所述纳米盘
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纳米孔蛋白质复合物的群体各自包含天然纳米孔蛋白质；(b)提供包含第二脂质的膜；以及(c)将所述膜与包含所述天然纳米孔蛋白质的纳米孔
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纳米盘复合物的群体接触，以使天然纳米孔蛋白质同化所述膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：斯特拉托斯基因公司，
类型：发明
国别省市：