本发明专利技术提供了一种基于蛋白质组学技术，研究Ｐ１９ＣＬ６细胞向心肌细胞分化前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法。本发明专利技术在验证Ｐ１９ＣＬ６细胞在１％ＤＭＳＯ诱导下成功分化成心肌细胞的基础上，应用上述的方法，提供了Ｐ１９ＣＬ６细胞向心肌细胞分化前后有意义的差异表达蛋白。其中Ｙｂｘ－１在Ｐ１９ＣＬ６细胞分化为心肌细胞后表达上调，Ｙｂｘ－１与Ｐ１９ＣＬ６细胞向心肌细胞的分化密切相关，参与心肌细胞分化的表达调控。Ｙｂｘ－１可用于干细胞种植心肌再生或心肌细胞重建治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型的组合方法，该方法能够用于心肌细胞体外分化过程中差异表达蛋白的筛选和鉴定。本专利技术进一步提供了该方法鉴定的差异表达蛋白及其应用，涉及心肌细胞分化前后差异表达蛋白Ybx-1在干细胞治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞中的多种应用，诸如药物、诊断和治疗应用。
技术介绍
冠心病和心肌病是常见的心血管疾病，它们都可以引起心肌的损伤甚至坏死。由于心肌细胞属于终末分化的细胞，在出生后就失去增殖能力或增殖能力极低，因此干细胞定向诱导分化为心肌细胞，修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为治疗心肌梗死的一种替代手段。P19CL6是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系，用含1％DMSO的分化培养基培养时，该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调，10天左右就可以观察到肌小节肌球蛋白重链(MHC)的表达。该细胞系的成功建立及其体外成功诱导分化为心肌细胞，为我们在体外研究心肌细胞的分化提供了良好的模型，也为干细胞治疗心血管疾病提供了新的思路。心肌细胞的分化是一个极其复杂的过程，由于涉及不同时间段若干基因的先后表达，故难以用单一的检测方法对差异表达的基因和蛋白逐一进行研究。而基因只是遗传信息的载体，它的表达产物蛋白质才是行使生命功能的直接因素。因此引入高通量的系统、同步研究方法，成为目前寻找差异表达蛋白的突破口。蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学，它在蛋白质水平定量、动态、整体地研究生物体的生理或病理过程，并由此获得对疾病过程中细胞生理和生化过程及其调控网络的广泛而完整的了解。寻找P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白，从中挖掘可能具有重要功能的蛋白，有助于我们更好的理解心肌细胞分化的机制，对于应用干细胞治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞具有重要的意义。Ybx-1是P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中表达上调的蛋白，属于冷休克结构域(coldshock domain)超家族的一员，它在不同的生物过程中行使转录和翻译调节，药物抗性，DNA修复和细胞增殖等功能。Ybx-1在不同的组织广泛表达，在心脏，肌肉，肝，脑等表达量较高，敲除Ybx-1基因小鼠在E13.5天就会出现严重的发育迟缓，提示Ybx-1在胚胎发育过程中起到重要的作用。有研究报道Ybx-1可以结合于心肌特异表达的基因MLC-2v(cardiac myosinlight-chain 2v)启动子区并激活含有MLC-2v启动子的报告基因的活性，而转录抑制因子CARP(cardiac ankyrin repeat protein)作为心肌早期分化的标志(已经证实为Nkx2-5的下游靶蛋白)，也在胚胎发育过程中在心脏高表达，它可以结合Ybx-1，二者共同调节MLC-2v基因的表达，使得MLC-2v维持合适的表达水平。在P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中，二者的表达水平均升高，因此我们推测Ybx-1与CARP共同促进心肌细胞的分化。本研究通过寻找P19CL6细胞分化为心肌细胞前后差异表达蛋白，发现Ybx-1在P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达明显上调具有重要意义，对深入研究Ybx-1在心肌细胞分化过程中的功能提供了基础，具有潜在的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术是在验证P19CL6细胞在1％DMSO诱导下成功分化成心肌细胞的基础上进行的。我们用抗MHC的单克隆抗体MF20检测其表达情况。未用DMSO诱导的P19CL6细胞，MF20染色为阴性；而用1％DMSO诱导12天的细胞，MF20染色为阳性。我们同时检测了心脏特异性的转录因子Nkx2-5、GATA-4、MEF2C的mRNA在诱导前后的表达变化，这些转录因子可以作为心肌细胞分化成功的标志，它们在诱导12天后的P19CL6细胞表达明显升高，说明P19CL6细胞用1％DMSO诱导12天成功的分化为心肌细胞。本专利技术要解决的技术问题在于设计P19CL6细胞向心肌分化前后差异表达的蛋白的筛选和鉴定方法。本专利技术提供了一种基于蛋白质组学技术的研究P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法。本专利技术的方法包括以下步骤(1)双向电泳样品处理；(2)IPG胶条的等电聚焦分两步首先是干胶条的泡胀过程，同时样品中的蛋白质也随电泳液一起进入胶内；第二步是真正的聚焦过程，蛋白质根据其等电点逐渐迁移到对应的pH位置；(3)第二向SDS平衡，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶染色；(4)图像扫描与分析，寻找差异蛋白点；(5)P19CL6向心肌细胞分化前后差异蛋白的鉴定，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析方法，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽图谱进行数据库查询，鉴定差异表达的蛋白。在上述工作基础上，本专利技术的目的是提供P19CL6细胞向心肌细胞分化前后有意义的差异表达蛋白。Ybx-1在P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达上调，Ybx-1与P19CL6细胞向心肌细胞的分化密切相关，参与心肌细胞分化的表达调控。本专利技术的目的还在于Ybx-1可用于干细胞种植心肌再生或心肌细胞重建治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞，以及围绕Ybx-1而开发的相应治疗心脏疾病的新方案。小结本专利技术应用实时荧光定量技术(Real time PCR)、免疫荧光等技术，证实P19CL6细胞成功的分化成心肌细胞。在此基础上，应用双向电泳技术寻找P19CL6细胞分化前后差异表达的蛋白点，通过基质辅助激光解析电离质谱测量法(MALDI-TOF-MS)鉴定，本专利技术发现Ybx-1在P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中表达上调；我们还用电喷雾电离质谱对Ybx-1蛋白点PMF中的两个肽段1696.03和1795.99进行测序，测序结果与Ybx-1的氨基酸序列完全匹配；本专利技术还应用Real-time PCR技术进一步证实Ybx-1 mRNA在分化过程中表达水平上调；本专利技术获得了Ybx-1的cDNA克隆，并得到了Ybx-1的抗体，为深入研究Ybx-1在心肌细胞分化中的功能奠定了良好的基础。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步阐述。图1，A用MF20抗体检测肌球蛋白重链的表达BReal time PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5，GATA-4，MEF2C的mRNA表达水平图2，P19CL6细胞(A)和1％DMSO诱导分化12天的P19CL6细胞(B)2-DE图谱的比较图3，放大显示的3号差异蛋白点图4，2-DE胶中3号差异蛋白点进行基质辅助激光解析电离质谱测量法(MALDI-TOF MS PMF)鉴定，结果显示该蛋白点为Ybx-1图5，电喷雾电离质谱技术对3号差异蛋白点(Ybx-1)的PMF中1696.03(A)和1795.99(B)进行测序的结果图6，Ybx-1在P19CL6细胞向心肌细胞方向分化过程中mRNA水平升高具体实施方式在下面的实施例中进一步说明了本专利技术，但并不限制本专利技术的范围。实施例11)细胞固定用PBS清洗细胞两次，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15min。2)PBS漂洗，3×5min。3)细胞透化室温下，0.2％Triton/PBS透化处理12min。4)PBS漂洗，3×5min。5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种寻找Ｐ１９ＣＬ６细胞分化为心肌细胞前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法，该方法包括以下步骤： （１）样品进行双向电泳处理； （２）ＩＰＧ胶条的等电聚焦分两步：首先是干胶条的泡胀过程，同时样品中的蛋白质也随电泳液一起进入胶内；第二步是真正的聚焦过程，蛋白质根据其等电点逐渐迁移到对应的ｐＨ位置； （３）第二向ＳＤＳ平衡，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶染色； （４）图像扫描与分析，寻找差异蛋白点； （５）Ｐ１９ＣＬ６向心肌细胞分化前后差异蛋白的鉴定，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析方法，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽图谱进行数据库查询，鉴定差异表达的蛋白，其中之一为Ｙｂｘ－１蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温见燕，夏晴，陆彩玲，尹丽娜，龚燕华，阴彬，彭小忠，袁建刚，强伯勤，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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