由标本切片获得图像的方法技术

本发明专利技术涉及由标本切片获得图像的方法，该方法包括：重复地获得标本（１）的表层的图像，并且去除标本的表层，由此把下一切片带到表面；其特征在于在至少其中一次去除表层之后，将标本暴露于着色剂。该方法尤其适合用于装备有扫描电子显微镜柱（２０）和聚焦离子束柱（１０）的粒子－光学仪器中。例如，通过将诸如ＯｓＯ↓［４］（四氧化锇）的气体注入到标本，能够在原位置上对标本着色。该方法还可以通过下述来执行对比着色：首先制作暴露于第一种着色剂的标本的图像，随后，当利用第二种着色剂对标本进行附加着色时，制作标本的图像。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术有关一种由标本切片(slice)获得图像的方法，该方法 包括重复地-获得标本的表层的图像，和-去除标本的表层，由此把下一切片带到表面.
技术介绍
从例如具有离子-光学柱和电子-光学柱二者的粒子-光学装 置，诸如来自FEI公司的商用DualBean^仪器中，可获知这种重复地 去除表层(也称为切片)并获取标本图像的方法。要注意，本专利技术的上下文中的'图像，应解释为既是在显示单元 上显示的图像，又是在例如计算机存储器中的其表征。将这种方法应用于工业和实验室中，例如用来分析和检查生物标 本和聚合物标本，再如用来形成生物組织和聚合物中结构的三维(3D)重构。用于执行该已知方法的仪器包括电子-光学柱，其通过在标本上 进行聚焦高能电子束扫描来获取标本的图像，并且典型地高能电子 的能量在0.1-30 keV之间。从扫描电子显微镜(SEM)中，可获知这 种柱的工作方式。在电子束撞击标本的位置，响应撞击电子的轰击， 可能会发射诸如二次电子、反向散射电子、X射线和光的二次辐射. 通过对由例如二次电子探测器(SED)发射的二次电子数量进行探 测，能够获取(依赖于位置的)标本表面的信息.该信息能够作为 图像在显示器上显示，或者能够把所述图像存储起来用于将来检索 或处理。如此获取到标本表面的图像之后，可以使用离子柱去除表层。从 聚焦离子束(FIB)仪器中，可获知这种柱的工作方式。所述柱发射高 能离子聚焦束，诸如具有例如40 keV能量的Ga+离子束.在离子束 撞击标本的位置，材料被去除。通过在离子束撞击标本位置的附近导入特定气体，使这种去除得到了极大的增强.这种离子束能够扫 过所述表面，由此滞留时间(与诸如当前密度和能量的离子束特性 一同)决定了表层会被去除多少。结果，去除了材料切片.去除了所述表层之后，新的表层暴露出来，并且用电子束能够获 取如此暴露的表层的图像。通过重复地获取表层的图像，并且从标本去除表层(从表层去除切片)，能够制成标本的3D重构。或者， 通过例如提供表面信息的技术，能够把标本内部的感兴趣的区域带 到表面来进行检查。问题是当观察某些诸如聚合物和生物组织的材料时，标本的对 比度可能太差而不能容易地区分标本的特征.正如本领域技术人员 所知，为了提高对比度，可以对标本进行着色来优先使标本的一些 部分比其他部分显得突出.为了使着色变得有效，人们必须优先约 束标本的一些部分，由此在标本不同的部分之间进行区分，在电子显微学中，可以使用重金属盐作为着色剂.这种重金属盐 通常由金、铀、钌、锇或钨得到.因为重离子易于与电子束相互作 用，并且产生相位对比度、吸收对比度和/或引起反向散射电子，所 以使用重离子，这些重金属盐中的一些会粘附到标本的特殊物质。0s04 (四氧化锇)就是一个例子，其形成与不饱和脂肪酸的-c-c-双键的特殊的化学反应。其他可以使用的着色剂例如是具有例如适当的生物活性基团(诸 如抗体)的重金属的化合物。这种着色剂也被称为标签. 一个例子 是被抗体吸收的胶体金粒子。其他的这种着色剂基团的例子是由美 国Nanoprobes Inc.生产的化11(^01(1*粒子，其可以用来标记任何具 有合适的反应基团诸如低核苷酸、脂质、肽、蛋白质和酶抑制剂的 分子。为了对标本进行着色，将该标本暴露于着色剂.所述暴露能够采 取把标本暂时浸入到诸如1%的0s04溶液的液体中的形式。着色处理 中更进一步的步骤可以包含用水、酒精等对标本进行清洗.这种着 色处理在例如John E. Scott和Constance R. 0rford的"Dermatan sulphate—rich proteoglycan associates with rat-tendon collagen at the d band in the gap region" (Biochem. J.， 第(1981) 197期，第213-216页)中进行了阐述，特别是在'materials and methods' —节中《所述暴露也能够采取把标本暴露于着色剂的气体或蒸汽的形 式。这在例如Y. Nagata等人的"Observation on backscattered electron image (BEI) of a scanning electron microscope (SEM) in semi-thin sections prepared for light microscopy" (Tokai J. Exp. Clin. Med. ， 1983 May 8(2)，第167-174页)中进行了阐 述.为了良好的对比度，必须对标本进行充分地着色.然而，着色剂 的剂量存在最优值过度着色会造成对比度降低，因为标本的太多 部分都变成被着色的了，由此(被着色的)感兴趣的结构不再相对 于背景突出。因此，必须寻找到着色的适当剂量.着色剂和要被着色的材料的特定组合的问题是在标本中着色剂 的扩散率非常低。在生物组织中，许多重金属着色剂表现出低扩散率，而在聚合物中，扩散率甚至更低，结果，当例如对厚的聚合物 标本进行着色使其表面被着色到适当的水平之时，标本的内部没有 被充分着色以获得良好的对比度.然而，若着色使其内部得到充分 着色，则表面又会着色太重以致不适合获得良好的图像.因此，需要以这样一种方式对厚的标本进行着色，即把整个标本 着色到适当的水平。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于以这样一种方式对厚的标本进行着色 的方法，即整个标本能够以适当的着色水平进行成像。为此目的，根据本专利技术的方法，其特征在于在至少其中一次去除 表层之后，将标本暴露于着色剂。通过每次剥离表层时对标本的表面进行再着色，能够将该表面每 次既着色到最佳的水平，又着色到恒定的水平。要注意，可以在每次单独地去除表层之后不必进行再着色，而仅 在预定数目的层之后需要再着色.这可以导致处理时间减少，并且 因此缩短周期时间。在根据本专利技术的方法的实施例中，用离子-光学装置获取图像。虽然该方法能够与不同种类的诸如光显微镜法和荧光显微镜法 的显微镜法一同使用，但是特别有吸引力的是与电子和离子显微镜 法一同使用.要注意，当每次去除表层之后仅对非常薄的如20nm的层进行着 色(例如，通过将标本短时间暴露于着色剂)时，作为另一优点， 扫描电子显微镜(SEM)图像的分辨率得到了改善.这能够解释如下在SEM中，通常通过探测反向散射的电子来观察着色的标本，因 为着色剂的重金属引起大量的反向散射.这种反向散射的电子能够 深入标本的内部(例如，表面之下0.5,)产生，并且仍可探测到. 这意味着，当重金属原子出现在标本内部深处时，仍可探测到它们， 这会造成图像不仅显示表面处着色结构的信息，还显示着色的表面 下结构的信息。通过仅对例如20 nm的薄层进行着色，仅仅在此薄 层中的着色结构对图像有所贡献.未着色标本的光原子只引起很少 的反向散射的电子，因此基本上将不会对图像有所贡献.结果，图 像因此只显示标本最上层中的着色结构，并且因此改善了图像的分 辨率。同样的作用还改善了例如从标本探测到的X射线的分辨率，所述 X射线是着色标本中电子束撞击重金属原子的结果.在根据本专利技术的方法的另一实施例中，使用粒子束去除表层.使用离子束或电子束本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于由标本切片获得图像的方法，该方法包括：　　　　重复地　　　　－获得标本（１）的表层的图像，和　　　　－去除标本的表层，由此把下一切片带到表面，　　　　其特征在于　　　　－在至少其中一次去除表层之后，将标本暴露于着色剂。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：JJL穆尔德斯，WM巴辛，L罗塞尔，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：US[]