利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法：在人工皮肤的培养过程中，需要观测人工皮肤的生长情况时，吸去人工皮肤的培养液，在人工皮肤表面滴加５－氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去５－氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基继续培养。本发明专利技术采用５－氯甲基二乙酸荧光素作为荧光成像物质来观测人工皮肤的生长过程，其成像更加清晰，轮廓清楚，并且荧光图像的维持时间更长，而且，５－氯甲基二乙酸荧光素作为活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。此外，该方法还具有过程稳定、易操作以及重复性强的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及观测人工皮肤生长过程的方法，特别是涉及一种利用荧光成像观测人工皮肤 生长过程的方法。
技术介绍
近年来人们研究发现体外重建的人工皮肤可以替代动物或人体皮肤而进行相关的试验， 如Sanz Garcia S等人用人工皮肤研究生物制剂对表皮生长的作用(Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg， 2000; 34 (3) : 199-206); Hoffmann J 等人用人工皮肤检测和鉴别化学物 质对皮肤的腐蚀作用(Toxicol In Vitro， 2005; 19(7) :925-929); Amano S等人利用人工皮肤 模拟皮肤的光老化过程(Br J Dermatol, 2005， 153(2) :37-46); Hada N等人利用人工皮肤作 为四环素和氯霉素的经皮给药系统，显示抗生素处理过的人造皮肤，可预防皮肤的二次感染 ，人工皮肤可作为一种新的体外经皮给药系统模型(J ControlRelease, 2005; 108 (2-3) :341-350)。由于人工皮肤提供了进行该方面研究和应用的良好替代 平台，因此具有较大的实际应用前景。在医学临床中，患者皮肤损伤或烧伤后所进行的皮片移植有助于创面修复。这个修复过 程包括移植皮片边缘的角质形成细胞分裂增殖，向创面移行，最后覆盖创面，新生表皮完成 修复和重塑的过程。这一过程涉及到皮肤的再生和发育，对这一过程的了解可以帮助人们认 识与皮肤发育和修复相关的诸多问题，有助于了解各种理化因素对组织修复的影响，寻找伤 口愈合的新药。 一般新药研究比较复杂，研制过程须多个步骤，以往多采用动物或人进行药 物的筛选、毒理学实验、以及生理功能研究等，这时需要大量的动物和人体皮肤进行不同浓 度的重复试验。这样，往往会导致人或动物的损伤，甚至导致动物死亡。多年来人们期望在 体外建立一种人工皮肤损伤修复模型，以便用这个模型对影响皮肤生长的各种因素(如细胞 因子、激素、物理因素及各种药物等)进行量化评估。但是，由于技术的限制，尚无理想的方法客观测量人工皮肤的生长。1986年Coulomb B 等人曾用染料染色人工培养的皮肤组织，观察皮肤的生长(Br J Dermatol 1986; 114(1) :91-101)。该方法的缺点是染料对细胞生长有影响，难以准确反映新生皮肤的 生长过程。另外他们选用混合胶原凝胶作真皮替代物，这种皮肤替代物也存在明显的不足即 胶原凝胶会严重收縮，导致表皮生长受影响。后来，申请人曾用二乙酸荧光素结合荧光显微成像和图像分析技术，以人的去表皮真皮组织(HDED)作为真皮替代物初步建立了一种客观量 化重建皮肤生长的方法(陆洪光等，中华皮肤科杂志2005; 38 (12) :738-741)。 二乙酸荧光素 是一种细胞染色用荧光色素，为活细胞指示剂，广泛应用于动植物细胞活力的标记及检测 (Hassan M:Biotechnol Bioeng. 2002 ; 80 (6) :677-84)。但是在实际应用中发现经二乙酸荧 光素染色的人工皮肤荧光时间维持较短，时间长了以后荧光图像易出现模糊，不利于较长时 间对人工皮肤生长过程的观察。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种图像清晰、荧光持续时间更久的利用荧光成像 来观测人工皮肤生长过程的方法，该方法利于对人工皮肤的生长过程进行连续性观察并随时 同步摄像，从而记录、量化人工重建皮肤的生长速率。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下的方法利用荧光成像技术来观测人工皮肤的生 长过程在人工皮肤的培养过程中，需要观测人工皮肤的生长情况时，吸去人工皮肤的培养液， 在人工皮肤表面滴加5 —氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤 呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去 5 —氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基后继续培养。其中，5 —氯甲基二乙酸荧光素是浓度为2. 4mM的5 —氯甲基二乙酸荧光素的二甲基亚砜 溶液。为了能真实地反映皮肤的生长过程，所用到的人工皮肤最好采用如下的方法制备将皮 片的真皮面涂上混合组织胶并表皮部分向上、真皮部分向下地置于去表皮真皮组织上，所述 混合组织胶是用体积比为l: 1: l的胶原胶、氨甲环酸和凝血酶新鲜配制的。专利技术人对5—氯甲基二乙酸荧光素的荧光成像的时效和其对人工皮肤生长过程的影响进 行了研究，具体如下实验一、二乙酸荧光素和5 —氯甲基二乙酸荧光素荧光成像的比较将二乙酸荧光素150y l滴加至人工皮肤表面，将同体积的浓度为2.4yM的5 —氯甲基二 乙酸荧光素滴加至另一人工皮肤表面，分别移到荧光显微镜下观察，记时观察人工皮肤的荧 光图像，15秒钟后分别经两种荧光素处理的人工皮肤均出现荧光图像，5分钟时最为清晰， 清晰图像保持15分钟，经二乙酸荧光素处理的荧光图像30分钟后出现模糊，而5-氯甲基二乙 酸荧光素处理的荧光图像在30分钟后依然清晰，轮廓清楚，图像于l小时后边缘才开始模糊 ，尽管荧光图像随时间的延长荧光强度逐渐减低，但是72小时后仍可见5-氯甲基二乙酸荧光素处理的荧光图像。说明5 —氯甲基二乙酸荧光素的成像效果和持续时间均优于二乙酸荧光素。实验二、 5 —氯甲基二乙酸荧光素对人工皮肤生长的影响实验分5 —氯甲基二乙酸荧光素组和溶剂二甲基亚砜组每组12个人工皮肤标本进行器 官培养，连续培养10天。5 —氯甲基二乙酸荧光素组在连续性培养的第3天，第5天，第7天及第10天加荧光素摄 取人工皮肤荧光图像并计算新生皮肤生长面积；二甲基亚砜组作为对照组，于培养的第3天 ，第5天，第7天加同剂量的二甲基亚砜并于第10天加二乙酸荧光素后摄像并计算新生皮肤生 长面积。统计学显示于培养的第10天，5-氯甲基二乙酸荧光素组新生皮肤生长面积为21.97 ±5. 03mm2 、 二甲基亚砜组为23. 37±2. 36mm2，两组比较无统计学差异(P>0. 05)。结论5 —氯甲基二乙酸荧光素处理的人工皮肤荧光图像更加清晰，轮廓清楚，在人工 皮肤生长的连续性培养过程中，荧光图像维持时间较长，有利于人工皮肤生长情况的观察， 并且5—氯甲基二乙酸荧光素作为一种活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。与现有技术相比，本专利技术采用5 —氯甲基二乙酸荧光素作为荧光成像物质来观测人工皮 肤的生长过程，其成像更加清晰，轮廓清楚，并且荧光图像的维持时间更长，而且，5 —氯 甲基二乙酸荧光素作为活细胞指示剂不会影响人工皮肤的生长。此外，该方法还具有过程稳 定、易操作以及重复性强的特点，便于量化检测各种因素(尤其是药物)对皮肤生长的影响 和调控等。具体实施例方式实施例l:表皮皮片的制备取整形外科切除的正常皮肤，置于超净工作台，自然平展标本，用2mm活检器取样。然后将取下的皮片放于盛有PBS的平皿中，在解剖显微镜下用剪刀小心去除 皮下组织及深层真皮组织，保留浅层真皮组织，即得表皮皮片。去表皮真皮组织的制备取整形外科切除的皮肤标本，常规消毒，在超净工作台中，在 解剖显微镜下修剪至2. 5mm厚，用10mm的活检器取材，将取下的标本浸于PBS中，然后置于56 。C的水浴箱中30min，取出后将表皮与真皮分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用荧光成像观测人工皮肤生长过程的方法，其特征在于：在人工皮肤的培养过程中，吸去人工皮肤的培养液，在人工皮肤表面滴加５－氯甲基二乙酸荧光素，然后移至荧光显微镜下观察，新生人工皮肤呈兰绿色荧光，以兰绿色荧光判断人工皮肤的生长情况，观测人工皮肤的生长情况后，吸去５－氯甲基二乙酸荧光素，加入培养基后继续培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆洪光，
申请(专利权)人：陆洪光，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]