胆固醇测定制造技术

本发明专利技术涉及测定样品（例如血样）中胆固醇浓度的方法。所述方法包含下列步骤：将引起Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ－Ｂｕｒｃｈａｒｄ（Ｌ－Ｂ）反应的试剂加入到样品；然后利用荧光分析测定样品中总胆固醇浓度。本发明专利技术也涉及用于进行本发明专利技术方法的装置，并且特别是以阅读器和盒形式的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胆固醇测定本专利技术涉及区别样品混合物中不同类别脂质分子的测定系统。特别 是，本专利技术涉及确定血浆或血清中胆固醇浓度的方法。本专利技术还涉及实施 所述方法所用的装置。脂质是活生物体中存在的有机化合物的一个多样组。它们在水中是不 溶的，但是可溶于有机溶剂。将脂质广泛分类成两个类别(i)复杂脂质； 和(ii)简单脂质。复杂脂质是长链脂肪酸的酯并且包括甘油酯类、糖脂类、 磷脂类、胆固醇酯类和蜡。不含有脂肪酸的简单脂质包括类固醇类(例如， 胆固醇)和萜类。脂质可以与蛋白质结合形成脂蛋白，其为这样的形成，即其中脂质， 诸如胆固醇和甘油三酯在血液和淋巴中输送。为了简短，在这里使用术语 "血清"，但是涉及"血清"应当解释为涉及血清或血浆。在血浆中发现 的脂蛋白属于三个主要分类(i)高密度脂蛋白(HDL)， (ii)低密度脂蛋白(LDL)，和(iii)非常低密度的脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。胆固醇在血流中主要以LDLs形式输送，并且利用肝中的LDL受体从 血液除去。将含有胆固醇的LDLs结合到LDL受体，然后将其摄入细胞。 作为遗传缺陷发生在一些个体中的LDL受体缺乏，被认为是血液中高水 平胆固醇的原因，使他们易于患动脉粥样硬化，即有害斑块在血管壁上的 发展，其可以导致心脏病发作和中风。充分证明的是，在血浆中多种脂蛋 白浓度和动脉粥样硬化风险之间存在有力的关系。同样己知，不同类别的 脂蛋白(HDL、 LDL和VLDL)在动脉粥样硬化中各自起不同的作用。例如， 将HDL认为是抗致动脉粥样化的(antiatherogenic)，而已知LDL是高度致 动脉粥样化的(它携带的胆固醇与动脉粥样硬化的发展密切相关)。VLDL 被认为是轻微致动脉粥样硬化的，而且在女性中更显著。因此多种脂质成分的每一种，特别是胆固醇，在血液中的相对浓度的 知识，将是有利的，因为这将在治疗具有这些脂质的不适当血液浓度的患 者中帮助临床医生。已经开发了用于确定血液中一些脂质成分浓度的测定。这样的测定通 常涉及首先从患者取血样，然后将其送到临床实验室用于分析。这样的测 定不得不利用昂贵的装置和试剂进行，并且需要相当长的时间以产生结 果。这耽搁治疗。而且，所述测试是复杂的并且因此是昂贵的。另外，在 实验室中使用的装置不容易便携，并且因此不能由GPs或护士在出诊时使 用，或者甚至作为家用测试试剂盒使用。因此，存在提供用于分析血液血 清中脂质并且特别是胆固醇浓度的改进方法的需要。Liebermann-Burchard(L-B)反应测定是测量血液中总胆固醇的众所周 知方法，并且被认为是"金标准"。这是基于吸光度的测定，并且附图说明图1显 示该Liebermann-Burchard反应的示意图。首先，制备由30%冰醋酸、60% 乙酸酐和10。/。硫酸的溶液组成的L-B反应试剂。其次，然后将5 ml该L-B 试剂加入到0.2 ml由血浆获得的样品，将其混合在一起然后进行放置20 分钟。L-B反应通常在包含已经从血浆萃取到有机溶剂中的胆固醇样品上 进行。L-B反应的产物是两个有色的产物。Liebermann-Burchard反应产物 的典型吸光度光谱显示在图2中。然后利用分光光度计测量产物的吸光度， 所述产物的浓度与胆固醇浓度相关。可以利用胆固醇标准物，从吸光度对 胆固醇浓度的校正曲线确定胆固醇的总浓度(Burke等，Clin. Chem. 20(7)， 794-801(1974))。然而，L-B反应测定的问题是它需要相对大量的试剂，这是一个明显 的缺点，因为所述试剂是非常腐蚀性的并需要特殊关注。通常同样需要的 是，将胆固醇从血浆萃取并且该萃取步骤构成测定中麻烦的额外步骤。因 此，L-B反应测定在许多实验室中己经由酶联测定取代，因为在L-B反应 测定中需要相当大量的样品数量并且使用腐蚀性试剂。然而，用于确定总 胆固醇浓度的这样的酶-联测定的使用趋向于更容易和更安全地进行，但是 不如L-B测定精确。因为产生的结果是不太精确的，所以临床医生将优选 L-B反应测定准确度，特别是对于具有更高冠心病危险因素的个体确定治 疗过程时。因此，即使存在测定血液样品中胆固醇浓度的有效方法，也应当理解 这些方法具有许多限制。因此本专利技术实施方案的目的是排除或减轻现有技术的问题，并且提供 用于测定取自受试者的样品中胆固醇浓度的改进方法。进一步的目的是提 供用于实施所述方法的装置。如上所述，常规的L-B反应测定测量吸光度，因此需要相对大体积的 L-B反应试剂。例如，用于测量吸光度的比色杯趋向于保持约1 ml的样品 而起作用。应当理解，L-B试剂的成分是非常腐蚀性的，其因此在使用时 需要特殊的关注。因此，对于测量血样中的胆固醇浓度，L-B测定由实验 室技术人员使用是相当麻烦的。因此，本专利技术人用L-B测定的试剂进行了一些研究，以了解是否可以 提供改进的测定用于测定血样中的胆固醇浓度，以致它们是更容易使用 的，更少危险的，以及更精确的。从他们的研究中，他们非常地惊奇地发 现L-B反应的产物实际上发荧光，并且图3显示L-B产物的荧光发射光谱。 意外观察到，所述荧光在470-600 nm的范围延伸。因此，根据本专利技术的第一个方面，提供测定样品中总胆固醇浓度的方 法，所述方法包含下列步骤-(i) 向样品中加入引起Liebermann-Burchard(L-B)反应的试剂；禾口(ii) 利用荧光分析测定样品中的总胆固醇浓度。由所述术语"总胆固醇"，本专利技术专利技术人指的是样品中的胆固醇总浓 度，其包括结合到载体分子诸如脂蛋白例如LDL的全部胆固醇，以及可 以存在于样品中的任何游离胆固醇。样品可以是食品，其需要分析在其中的总胆固醇浓度。优选地，所述 样品是生物样品，其可以从要测试的受试者获得。所述样品可以包含任何 生物流体，例如，血液血清或血浆，或淋巴。特别优选的是，所述样品包 含血液血清。本专利技术方法的另一个好处是可以在所述方法中直接使用液体 样品(例如血清或血浆)。这与常规的L-B反应测定相反，所述L-B反应测 定可能需要从初级样品萃取胆固醇，之后将其与L-B试剂结合。用于胆固醇的Liebermann-Burchard(L-B)反应是众所周知的，并且显 示L-B反应的示意解在图1中。优选地，加入到样品的试剂导致存在于样品中的全部总胆固醇即胆固醇及其酯的反应，其可以与脂蛋白缔合(例如LDL或HDL)，其可以存在于样品中。L-B试剂优选将双键添加到样品 中的胆固醇，如图l中所图解。因此，由术语"引起L-B反应的试剂"， 本专利技术专利技术人指的是当加入到含有胆固醇的样品时，引起或诱导样品中胆 固醇愈加不饱和的试剂。根据本专利技术第一个方面的方法使用与一般Liebermann-Burchard反应 测定(L-B)或用于测定胆固醇浓度的其它测定相同的试剂，所述其它测定可 以基于L-B反应，例如，Abell-Kendal测定，其对于技术人员将是己知的 (Abell等，J.Biol.Chem. 195(1)357-366页)。然而，不同于如常规L-B反应 测定中在550 nm测量有色产物的吸光度，根据本专利技术的方法包含测量荧 光以确定样品中的胆固醇浓度。因此，由术语"荧光分析"，本专利技术专利技术 人指的是L-B反应的产物的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定样品中总胆固醇浓度的方法，所述方法包含下列步骤：　　　　（ｉ）向样品中加入引起Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ－Ｂｕｒｃｈａｒｄ（Ｌ－Ｂ）反应的试剂；和　　　　（ｉｉ）利用荧光分析测定样品中的总胆固醇浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：加雷斯罗伊斯顿琼斯，托马斯戴维克拉克，
申请(专利权)人：科学技术设备委员会，
类型：发明
国别省市：GB[英国]