一种简易检测蛋鸡禽流感和新城疫免疫抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种简易检测蛋鸡禽流感和新城疫免疫抗体的方法，本方法不需要现场采血，可节省大量的医疗器械。本发明专利技术采样没有外人进入、不用捉鸡、采血，对鸡不会造成任何应激，产蛋率没有影响，很好地缓解了养殖户对采样的抵触情绪，有利于免疫监测的顺利进行。

【技术实现步骤摘要】
一种简易检測蛋鸡禽流感和新城疫免疫抗体的方法
本专利技术属于禽类疫病检测领域，具体说是。糊技术自高致病性禽流感H5N1在国内外发生以来，用疫苗免疫注射提高家禽的特异性免疫力，/工 高致病性禽流感的预防、控制中起到了重要作用。为了切实掌握高致病性禽流感、新城疫等重 大动物疫病的流行规律和疫情动态，及时发现和消除疫情隐患，每年省、自治区、直辖市人民 政府兽医主管部门根据国家动物疫病监测计划下达本行政区域的动物疫病监测计划。鸡高致病性禽流感、新城疫免疫效果的监测，需要按一定比例采样，抽取鸡血析出血清后， 做血凝和血凝抑制试验来判定结果。采取鸡血需要专业技术人员操作，并且需要采取必要的防 护隔离措施，如穿戴隔离服、手套、口罩、头套、脚套等，消耗大量的人力、物力。并且捉 鸡、采血使鸡产生较大的应激反应，对蛋鸡产蛋有一定的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供。本方法用鸡 蛋检测高致病性禽流感免疫抗体，不需要现场采血，采样不需要专业技术，由养殖户自己即可 完成，不需要几人进入鸡舍，可少用或不用采取防护措施。本专利技术技术方案如下1禽流感血凝(HA)试验(表格见附表一)1.1在微量反应板的l一4排的1 —12孔均加入0.025mlPBS液，更换滴头。1.2吸取0. 025ml禽流感H5亚型抗原液加入第1孔，用微量移液器反复吹吸混匀。1.3从第1孔吸取0.025ml抗原混合液加入第2孔，混匀后吸取0. 025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第ll孔，至第11孔吸取0.025ml弃之，更换滴头。 1.4每孔再加入0.025mlPBS液。 L5每孔均加入0.025ml 1%的鸡红细胞悬液。1.6将反映板放在微量振荡器上振荡l一3分钟，置2CTC—25'C室温(如果环境温度太低可放 在25"恒温箱内)下静置40分钟后观察结果，对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。1.7结果判定将反应板倾斜，观察红细胞有无泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原最高 稀释倍数代表一个血凝单位。以完全血凝的抗原最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数(取4个结果的平均值)除以4 即为含4个血凝单位的抗原的稀释倍数。 注新城疫血凝试验与禽流感血凝试验操作步骤基本相同，只是在1.2步中抗原液更换为新城 疫抗原。2、禽流感血凝抑制(HI)试验(表格见附表二)2.1把己编好号的鸡蛋用消毒剂洗净，再用清水漂洗干净，擦千备用。2.2在微量反应板的第l孔、第12孔加入0. 05mlPBS液、2 — 11孔均加入0. 025ralPBS液。2.3把鸡蛋磕开，沥出蛋清，只留蛋黄在半边蛋壳中，用5ml注射器(去除针头)吸取蛋黄().2一0.5ml，滴l滴(0.05ml)于微量反应板第l孔内。可如此反复，把其他鸡蛋样品加入微量反应板每排的第l孔内。 2.4把微量反应板放在快速混匀器上(用手扶牢以免倾斜溢出)振荡2 — 5分钟，使蛋黄与PBS液充分混合后，吸取0.05ml弃之(或做新城疫抗体检测)，吸取0.025ml加入第2孔，用微量移液器反复吹吸混匀吸取0. 025ml加入第3孔，依次对倍稀释至第10孔吸取0. 025ml弃之。2.5 l — ll孔均加入含4单位抗原的H5亚型抗原液0.025ml，放在微量振荡器上振荡混匀，置20°C —25。C室温下静置30分钟。 2.6每孔加入0.025ml的1%的鸡红细胞悬液，放在微量振荡器上振荡混匀，静置40分钟。 2.7结果判定以完全抑制4个单位抗原的最高稀释倍数作为HI滴度。判定结果时为避免卵黄的影响，可 在微量反应板反面观察凝聚图形，HI价大于或等于5Log2判定免疫良好。注微量移液器可使用单道、8道、12道移液器。3新城疫血凝抑制(HI)试验(表格见附表三)在微量反应板的2—11孔均加入0. 025mlPBS液，第12孔加入0. 05mlPBS液。把步骤2. 4 中第1孔中应弃去的0. 05ml蛋黄液，0. 025ml加入第1孔，另0. 025ml加入第2孔使蛋黄液与 PBS液充分混合后，吸取0. 025ml加入第3孔，依次对倍稀释至第11孔吸取0. 025ml弃之。其 他依照禽流感检测进行。 试验用溶液的配制1PBS液的配制磷酸二氢钠 0.316g 磷酸氢二钠 1.096g 氯化钠 8.5g加蒸馏水至1000ml用氢氧化钠或盐酸调PH至7.2。灭菌后于4'C保存不超过3周。2 阿氏液的配制葡萄糖2. 05g柠檬酸钠0. 80g柠檬酸0. 055g氯化钠0. 42g加蒸馏水至100ml ，用氣氧化钠或盐酸调ra至6. 1。灭菌后于4。C保存备用。3 1%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合， 以1000转/分钟离心10分钟，洗漆3次，洗涤后用PBS液配成体积分数为1 %的红细胞 悬液，4'C保存备用。4 4单位抗原液的配制以完全血凝的抗原最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数(取4个结果的平均值)除以4即 为含4个血凝单位的抗原的稀释倍数，用PBS液稀释后备用。本专利技术采样没有外人进入、不用捉鸡、采血，对鸡不会造成任何应激，产蛋率没有影响， 很好地缓解了养殖户对采样的抵触情绪，有利于免疫监测的顺利进行。因用鸡蛋检测鸡新城疫 抗体经常使用，自2005年用疫苗免疫注射预防鸡高致病性禽流感以来，能否用鸡蛋检测高致病 性禽流感免疫抗体，就成为采样人员和养殖户经常提出的问题。我们经过近3年的努力，做了 多次血清与鸡蛋检测高致病性禽流感抗体的对照试验，改进了检测方法，取得了满意的结果。用鸡蛋检测高致病性禽流感免疫抗体，采样不需要专业技术，由养殖户自己即可完成。不 需要几人进入鸡舍，可少用或不用采取防护措施。本方法科学地把0.05ml转变为0. 025ml,改变了过去按照新城疫检测方法检测与标准不一 致的问题，也节约了抗原的使用量。蛋黄粘稠不预处理不易混匀，容易造成微量移液器滴头堵 塞，倍比稀释移液不准确，人为造成离散度偏高，影响检测结果，影响多道微量移液器的使用，降低检测效率。使用快速混匀器，蛋黄液混合均匀无需另作处理，解决了因蛋黄粘稠对倍稀释 不准确的问题。用检测禽流感应弃去的卵黄液与检测新城疫抗体相结合，疫病监测更方便。提 高了用鸡蛋检测抗体水平的科学性、准确性。本技术方案简单、新颖、实用，方法易于掌握。 应用化验室的现有设备与现有技术水平，适当调整操作方法即可完成。适用于县级实验室的常 规监测和集中监测以及鸡场化验室定期检测抗体水平提供免疫依据。 试验优点1用鸡蛋代替蛋鸡血清，降低了采样难度。2科学地把0.05ml改为0. 025ml,与国标一致，也节约了抗原的使用量。3蛋黄液混合均匀无需另作处理，解决了因蛋黄粘稠对倍稀释不准确的问题。4可与新城疫抗体检测相结合疫病监测更方便。注意事项1用鸡蛋检测抗体略有一定的滞后性，可后延1-2天采样。本方法适用于免疫蛋鸡群的常规监 测和集中监测，不适用于发病蛋鸡群的抗体检测。禽流感、新城疫抗体检测可单独进行，也 可调换顺序。2试验要使用110°有机血凝板，严禁使用一次性血凝板。用过的血凝板及时用水龙头冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2次，甩干水后，放在37'C恒温箱内干燥备用。 3试验前应先把血凝板编号，同时清楚标记所做样品的编号，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简易检测检测蛋鸡禽流感免疫抗体的方法，其包括如下步骤：禽流感血凝抑制试验：步骤１，把已编好号的鸡蛋用消毒剂洗净，再用清水漂洗干净，擦干备用；步骤２，在微量反应板的第１孔、第１２孔加入０．０５ｍｌＰＢＳ液、２－１１孔均加入０．０２５ｍｌ ＰＢＳ液；步骤３，把鸡蛋磕开，沥出蛋清，只留蛋黄在半边蛋壳中，用５ｍｌ注射器吸取蛋黄０．２－０．５ｍｌ，滴０．０５ｍｌ于微量反应板第１孔内，如此反复，把其他鸡蛋样品加入微量反应板每排的第１孔内；步骤４，把微量反应板放在快速混匀器上振荡２ －５分钟，使蛋黄与ＰＢＳ液充分混合后，吸取０．０５ｍｌ用做新城疫抗体检测，再吸取０．０２５ｍｌ加入第２孔，用微量移液器反复吹吸混匀吸取０．０２５ｍｌ加入第３孔，依次对倍稀释至第１０孔吸取０．０２５ｍｌ弃之；步骤５，１－１１孔均加入含４单位 抗原的Ｈ５亚型抗原液０．０２５ｍｌ，放在微量振荡器上振荡混匀，置２０℃－２５℃室温下静置３０分钟；步骤６，每孔加入０．０２５ｍｌ的１％的鸡红细胞悬液，放在微量振荡器上振荡混匀，静置４０分钟；步骤７，结果判定：以完全抑制４个单位抗原的最高 稀释倍数作为ＨＩ滴度，判定结果时为避免卵黄的影响，可在微量反应板反面观察凝聚图形，ＨＩ价大于或等于５Ｌｏｇ２判定免疫良好；新城疫血凝抑制试验：在微量反应板的２－１１孔均加入０．０２５ｍｌＰＢＳ液，第１２孔加入０．０５ｍｌＰＢＳ液，把上述步 骤４中第１孔中吸取的０．０５ｍｌ蛋黄与ＰＢＳ混合液取０．０２５ｍｌ加入第１孔，另０．０２５ｍｌ加入第２孔使之与ＰＢＳ液充分混合后，吸取０．０２５ｍｌ加入第３孔，依次对倍稀释至第１１孔吸取０．０２５ｍｌ弃之，其他依照上述禽流感血凝抑制试验进行，只是将步骤５中Ｈ５亚型抗原液换成新城疫抗原液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦凤云，
申请(专利权)人：秦凤云，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]