本发明专利技术公开了提供了一种检测快速方便，实用性强的含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法，并提供了副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原及其编码基因。本发明专利技术的有益效果为：①检测过程简便、快速、准确，实用性强，具有较强的推广与应用价值；②敏感性高、特异性强、稳定性好；③用该诊断试剂可以检测副猪嗜血杆菌15血清型的抗体；④安全简便，不需要复杂的检测仪器和设备，检测结果直观。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原及其编码基因，以及含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。
技术介绍
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis , Hps)引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。近年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一。副猪嗜血杆菌病是世界性分布的条件性疾病，许多猪场有该病的存在。近年来我国养猪业发展很快，而饲养管理技术水平却相对滞后，饲养环境条件恶劣，疫病日益复杂，猪群健康水平下降，大多处于亚健康状态，这就为本病的发生与流行创造了条件。及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施是成功防制副猪嗜血杆菌病的关键。副猪嗜血杆菌的血清型众多，有15个血清型，还有20%分离株无法分型，所以给副猪嗜血杆菌病的诊断带了很大的困难，尤其是血清学诊断。随着分子生物学技术的发展，分子技术在细菌诊断领域广泛的应用，分子诊断在副猪嗜血杆菌的诊断中得到了广泛的应用，如基因限制性片段长度多态性分型(RFLP)技术(de Ia 2003 ；del Rio 2006等)、限制性内切酶技术(ERP) (Smart 1988)、肠杆菌基因间保守重复序列(ERIC) (Rafiee 2000)、单基因座序列分型技术和多为点序列分型(MLST)(Olvera 2006)，由于这些诊断方法需要专业的设备和技术，所以在临床上很难推广应用。Miniats (1991 )等用副猪嗜血杆菌的煮沸物或超声波破碎物致敏新鲜绵羊红细胞建立了 IHA和用副猪嗜血杆菌的煮沸物或热酚水透析物建立了 ELISA诊断方法；石碧(2007)等用副猪嗜血杆菌血清5型荚膜多糖建立了 IHA和ELISA诊断方法，检测效果明显优于前者。IHA和ELISA是目前国内外学者探索的主要副猪嗜血杆菌病抗体检测方法，所不同的是抗原的制备方法不同。但是这些诊断方法均具有一定的局限性，全菌超破抗原成分复杂，缺乏特异性，荚膜多糖抗原抗原虽有很好的特异性，但只能检测相应血清型的单一抗体。但在国内，副猪嗜血杆菌流行的血清型比较复杂,主要有血清型4型、5型，12型，13型，其他血清型在临床上偶能发生，所以单一抗体检测试剂不能满足实际生产需要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测快速方便，实用性强的。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原，具有序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供了编码上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因。进一步的，上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因，所述基因具有序列表中SEQ ID No:1的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供了含有基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。本专利技术的第四个目的是提供了表达副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的方法，是将含有上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原基因导入宿主细胞，表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原。进一步的，上述的方法，构建所述重组表达载体的出发载体为pET_30a ;所述宿主为大肠杆菌BL21。本专利技术的第五个目的是提供了含有上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。本专利技术的第六个目的是提供了上述副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂的制备方法，是将表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白纯化后进行复性，将纯化复性的OppA重组蛋白稀释为6-20mg/ml，之后与等量的5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞悬液混合，在37°C水浴中感作30分钟，期间每10分钟振摇一次，离心弃去上清，沉淀用pH7.2，浓度0.lmol/L的PBS悬浮，以3000rpm离心2分钟，洗涤2次；再用含1%灭活健兔血清的PBS悬浮，PBS的pH为7.2，浓度为0.lmol/L,以3000rpm离心2分钟，洗涤I次；最后将沉淀用含1%灭活健兔血清的PBS稀释成1%的致敏红细胞悬液，PBS的pH为7.2，浓度为0.lmol/L,分析检测合格即为副猪嗜血杆 菌病正向间接血凝诊断试剂。进一步的，上述副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂的制备方法，纯化后的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白，其复性过程为，以磷酸盐缓冲液配制的浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L和Omol/L的尿素溶液进行透析复性,尿素溶液pH均为6.0。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供了一种副猪嗜血杆菌病间接血凝诊断试剂及其制备方法，旨在解决现有技术提供的诊断副猪嗜血杆菌的方法，需专业技术和设备，并且这些诊断方法应用的局限性较大，无法满足副猪嗜血杆菌诊断的最大化需求的问题。诊断试剂由纯化复性的OppA可溶性蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞，建立了副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂，诊断试剂根据致敏的红细胞凝集度来确定待检样品中是否存在副猪嗜血杆菌抗体。本专利技术的优点具体表现在以下几方面:①检测过程简便、快速、准确，实用性强，具有较强的推广与应用价值；②敏感性高、特异性强、稳定性好；③用该诊断试剂可以检测副猪嗜血杆菌15血清型的抗体；④安全简便，不需要复杂的检测仪器和设备，检测结果直观。附图说明图1为本专利技术载体构建示意图，即载体的物理图谱。图2为红细胞凝集结果图片，其中，+:阳性样品；_:阴性样品。具体实施方式实施例1:1.副猪嗜血杆菌目的基因的获取 1.1反应体系 预混酶(宝生物):12.5 μι、引物(宝生物):各I 模板I 无菌双水:9.5 JiL ; 引物:上游引物 5 ’ -ATGCAAACAACCTTTACC-3， 下游引物 5’ -TTACTGCTTAATGATATA-3’ ； 1.2扩增条件94°C,5min ；94°C,50s ；51°C,40s ；72°C, 100s ；35 个循环。2.0ppA目的蛋白的获取 2.1将扩增OppA目的基因，与克隆载体pMD19-T连接，转化进大肠杆菌JM109 ;挑取阳性单克隆菌株，提取质粒；用 内切酶I和ZAo I对该质粒和Pet_30a进行双酶切，再用T4连接酶将其连接，然后转化进表达菌株BL21 (DE3)，以终浓度0.08mmol/L的IPTG进行诱导表达，如图1所示为载体构建示意图。2.2诱导后的菌液离心，将沉淀用PBS (pH为6.4,0.lmol/L)重悬，在冰浴中超声波破碎，IOOOrpm离心10分钟,取上清。上清中的目的蛋白OppA用His-Ni柱进纯化,His-Ni柱来源为 Merck(Novagen)，货号 70239-3, His.Bind。2.3 OppA纯组蛋白的复性，用磷酸盐缓冲液配制的浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L和Omol/L的尿素溶液透析复性，其中不同浓度的尿素溶液pH均为6.0。将复性的目的蛋白浓度稀释至6-20mg/ ml ο在Omol/L的尿素中透析2小时，即为复性。3.复性的OppA纯组蛋白致敏醛化-鞣酸化红细胞 将纯化复性的Op本文档来自技高网...
【技术保护点】
副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原，具有序列表中SEQ?ID?No：2的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：逯忠新，高鹏程，贺英，储岳峰，赵萍，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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