弹性蛋白测定制造技术

本文描述了单克隆抗体、测定试剂盒和用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的弹性蛋白片段的免疫测定方法，以及它们在检测或定量纤维化疾病诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】弹性蛋白测定
本专利技术涉及弹性蛋白测定和其在评估纤维化疾病诸如COPD中的用途。
技术介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征在于气道炎症、中性粒细胞和肥大细胞浓度过高(1，2)。中性粒细胞和肥大细胞在响应促炎介质而从中释放的颗粒中合成并存储预先形成的丝氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶G(CG)和蛋白酶3(PR3)。这些蛋白酶在一起具有针对细胞外基质(ECM)的广谱活性(3，4)。弹性纤维是肺的细胞外基质的主要不溶性组分，并且对细胞外基质的结构、功能、弹力以及弹性来说至关重要。弹性纤维由包埋在原纤蛋白微纤维中的交联弹性蛋白的内核芯构成(5)。它们在整个呼吸树上形成细且高度分支的网络，以支持呼吸期间肺泡的扩张和回缩。它们的特征在于健康的成人组织中的高稳定性和较低的转化。除选定的MMP外，只有少数蛋白酶诸如丝氨酸蛋白酶能够通过破坏弹性蛋白核心和微纤维来裂解弹性蛋白纤维(6-8)。在正常的炎性反应中，通过分泌内源性蛋白酶抑制剂(例如，硫酸乙酰肝素)来维持蛋白酶-抗蛋白酶的平衡(9)。在病理状态下，这一平衡被打破，导致弹性丧失，而这是COPD和肺气肿的主要病理特征(10，11)。已经提出丝氨酸蛋白酶CG和PR3在COPD中均被上调，但是目前没有能够将弹性蛋白降解的增加与那些蛋白酶相联系的标志物。本专利技术人现在已经开发了一种用于监测弹性蛋白的PR3降解的免疫测定，并证明了其在评估纤维化疾病，特别是COPD中的用途。
技术实现思路
相应地，本专利技术的第一方面涉及一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。优选地，所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。在这一方面，“所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本”是指一种或多种氨基酸伸展超过所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQIDNO:1)的C端。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQIDNO:1)延长一个苏氨酸残基，那么相应的“C伸展的延长版本”将是LPGGYGLPYTT-COOH(SEQIDNO:2)。类似地，“所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本”是指一种或多种氨基酸从所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQIDNO:1)的C端移除。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQIDNO:1)缩短一个氨基酸残基，那么相应的“C截短的缩短版本”将是LPGGYGLPY-COOH(SEQIDNO:3)。所述患者生物流体样品可以为，但不限于血液、尿液、滑液、血清、BALF(支气管肺泡灌洗液)或血浆。免疫测定可以为，但不限于竞争测定或夹心测定。类似地，免疫测定可以为，但不限于酶联免疫吸附测定或放射免疫测定。在第二方面，本专利技术涉及一种用于检测或定量患者的纤维化疾病的免疫测定方法，所述方法包括使患者生物流体样品与和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，确定所述单克隆抗体与包括所述C端氨基酸序列的肽之间的结合量，并且将所述结合量与以下相关联：i)与正常健康受试者相关的值和/或ii)与已知纤维化疾病严重程度相关的值和/或iii)在先前时间点从所述患者获得的值和/或iv)预定的截断值。优选地，所述纤维化疾病为慢性阻塞性肺疾病(COPD)。所述预定的截断值优选地为至少150.0ng/mL，更优选为至少175.0ng/mL，甚至更优选为至少200.0ng/mL，甚至更优选为至少225.0ng/mL，并且最优选为至少250ng/mL。在这一方面，通过各种统计学分析的结合使用，发现单克隆抗体(如上所述)与C端生物标志物之间的结合量为至少150.0ng/mL或更大时可以确定存在纤维化，诸如COPD。具有至少150.0ng/mL，更优选至少175.0ng/mL，甚至更优选至少200.0ng/mL，甚至更优选至少225.0ng/mL，甚至最优选至少250.0ng/mL的统计截断值时，有可能利用本专利技术的方法以高置信度诊断纤维化，诸如COPD。或者，换句话说，将统计截断值应用于本专利技术的方法是特别有利的，因为它实现独立的诊断测定；即，它不再需要与健康个体和/或疾病严重程度已知的患者进行任何直接比较来得出诊断结论。当利用该测定评估已经具有通常指示纤维化的医学征象或症状诸如COPD(例如，通过体格检查和/或与医学专业人员的咨询确定)的患者时，这也可能特别有利，因为它可以作为确证初始预后的快速且有力的工具，从而使得可能不再需要更具侵入性的程序诸如内窥镜检查或活检，并加快合适治疗方案的开始。快速的结论性诊断可使得疾病在早期被发现和治疗。优选地，预定的截断值对应于在人血液、血清或血浆中测量的截断值。优选地，所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。术语“C伸展的”和“C截短的”如上所述。所述患者生物流体样品可以为，但不限于血液、尿液、滑液、血清、BALF或血浆。在第三方面，本专利技术涉及一种确定患者对纤维化疾病诸如COPD的治疗是否有积极响应的方法，其中所述方法包括使用以上所述的方法来定量至少两种生物流体样品中的包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT的肽的量，所述生物流体样品是在向所述患者施用治疗期间于第一时间点和至少一个随后的时间点从所述患者获得的，并且其中在治疗期间，从所述第一个时间点到所述至少一个随后的时间点，包括所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT的肽量的减少表明所述患者对所述治疗有积极响应。上述方法还可用于确定新型疗法对治疗纤维化疾病诸如COPD的功效。在该方面，如果在使用所述新型疗法治疗期间，从所述第一时间点到所述至少一个随后的时间点，包括所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)的肽的量减少了，那么将认为所述新型疗法是有效的。在第四方面，本专利技术涉及一种单克隆抗体，其和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应。如本文中所使用，术语“单克隆抗体”延伸至和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的完整单克隆抗体及其抗体片段诸如Fab、Fv等。在第五方面，本专利技术涉及一种测定试剂盒，包括和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的单克隆抗体，和以下至少之一：-链霉亲和素包被的孔板-生物素化的肽生物素-L-LPGGYGLPYT(SEQIDNO:5)，其中L是任选的接头-用于夹心免疫测定的二抗-包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)的校准品肽-抗体生物素化试剂盒-抗体HRP标记试剂盒-抗体放射性标记试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180208 GB 1802070.11.一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述患者生物流体样品是血液、尿液、滑液、血清、BALF或血浆。


4.一种用于检测或定量患者的纤维化疾病的免疫测定方法，所述方法包括使患者生物流体样品与和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQIDNO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，确定所述单克隆抗体和包括所述C端氨基酸序列的肽之间的结合量，并且将所述结合量与以下相关联：i)与正常健康受试者相关的值和/或ii)与已知纤维化疾病严重程度相关的值和/或iii)在先前时间点从所述患者获得的值和/或iv)预定的截断值。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述纤维化疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述预定的截断值为至少150.0ng/mL。


7.根据权利要求4至6所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡罗利妮·纳塔西亚·施泰尔·古德曼，詹尼·玛丽·比洛·山德，蒂娜·玛农·詹森，戴安娜·朱利·利明，莫滕·卡尔斯达尔，
申请(专利权)人：北欧生物科技公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK