用于生物合成参与三羧酸循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的方法和材料技术

本发明专利技术提供了用于产生参与TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法和材料。本发明专利技术还提供了根据这些方法和材料产生的产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物合成参与三羧酸循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的方法和材料本专利申请要求2018年7月6日提交的美国临时申请序列号62/694,602和2018年2月1日提交的美国临时申请序列号62/624,874的优先权的权益，这两个临时申请中的每个的内容全文以引用方式并入本文。
本专利技术涉及用于产生参与三羧酸循环(TCA循环)的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的生物合成方法和材料。本专利技术还涉及由这些方法和材料生物合成或以其他方式涵盖的产品。正在考虑用环境友好(例如，绿色化学品)和/或“清洁技术”解决方案来替代依赖于例如化石燃料和/或潜在毒性化学品的传统化学生产工艺，包括识别适用于制造此类化学物质的构件的工作。参见“ConservativeevolutionandindustrialmetabolisminGreenChemistry”，GreenChem.,2018,20,2171-2191。TCA(三羧酸)循环，也称为Krebs循环或柠檬酸循环，是需氧菌中心代谢的关键代谢途径，并且是各种生物体的主要生物化学中心。TCA循环包括九个由八种酶进行的生物化学反应，以从乙酰-CoA产生能量(参见图1)。TCA循环也有助于用于合成代谢的代谢前体的合成。据报道，微生物TCA循环的代谢工程适合于生产工业相关化学物质，诸如琥珀酸(Lee等人ApplEnvironMicrobiol.200571(12):7880-7)、富马酸(Xu等人BioresourTechnol.2013148:91-6)、赖氨酸(Becker等人ApplEnvironMicrobiol.200975(24):7866-9)和1,4-丁二醇(Yim等人NatChemBiol.2011.7(7):445-52)。衣康酸也是来源于TCA循环的化学物质。该化合物在工业上用于制造合成聚合物，诸如塑料、树脂和胶乳。衣康酸生产是基于在衣康酸曲霉(A.itaconicus)(KinoshitaActaPhytochim.19325:271-287)中进行的实验发现的，但目前该分子是使用土曲霉(Aspergillusterreus，A.terreus)在工业上生产的。在土曲霉中，鉴定了编码顺式乌头酸脱羧酶的基因cad1(Kanamsa等人ApplMicrobiolBiotechnol.200880(2):223-9)。该酶将来自TCA循环的顺乌头酸转化为衣康酸(参见图1)。该基因的异源表达也使得能够在微生物中产生衣康酸，所述微生物包括酿酒酵母(S.cerevisiae)(Bazeck等人ApplMicrobiolBiotechnol.2014.98(19):8155-64)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(Bazeck等人MetabEng.2015.32:66-73)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(Otten等人MetabEng.2015.30:156-65)或大肠杆菌(E.coli)(Okamoto等人JGenApplMicrobiol.2014.60(5):191-7，Vuoristo等人ApplMicrobiolBiotechnol.2015.99(l):221-8，Harder等人MetabEng.2016.38:29-37)。据报道，cad1在大肠杆菌中的表达导致可检测但低量的衣康酸(Li等人FungalGenetBiol.2011.48(6):602-11)。另外的研究已报道衣康酸产生可通过代谢工程进一步改进。例如，研究已经显示，滴度可通过中断衣康酸前体顺式乌头酸下游的TCA循环的代谢通量而增加，这或通过缺失编码异柠檬酸脱氢酶的icd1(Okamoto等人JGenApplMicrobiol.201460(5):191-7)或通过下调led活性并缺失编码琥珀酰-CoA合酶的sucCD和编码参与乙醛酸循环的异柠檬酸裂解酶的aceA两者(Harder等人MetabEng.201638:29-37)(图1)。除了这些遗传修饰之外，据报道，来自大肠杆菌{acnB}或谷氨酸棒杆菌{acnA}的编码乌头酸水合酶的acn基因的过表达也导致产量的提高(Okamoto等人JGenApplMicrobiol.201460(5):191-7；Vuoristo等人ApplMicrobiolBiotechnol.2015.99(1):221-8)(图1)。谷氨酸棒杆菌柠檬酸合酶GltA的引入也增加衣康酸滴度(Vuoristo等人ApplMicrobiolBiotechnol.201599(l):221-8；Harder等人MetabEng.201638:29-37)(图1)。还报道了通过TCA循环人为增加碳通量作为获得更大衣康酸产量的方法。丙酮酸激酶活性的失活(通过缺失pyk)已经允许增加草酰乙酸的回补通量(图1)(Harder等人MetabEng.201638:29-37)。还已报道，当来自大肠杆菌中心代谢的碳通量被重新导向乙酰-CoA(衣康酸的前体)生产时，衣康酸水平更高。这通过缺失编码磷酸乙酰转移酶的pta或编码乳酸脱氢酶的ldhA来实现(图1)(Vuoristo等人ApplMicrobiolBiotechnol.2015.99(1):221-8；Harder等人MetabEng.201638:29-37)。然而，已经报道了在大肠杆菌中产生衣康酸方面的挑战。例如，根据一些报道，在37℃生长期间没有检测到衣康酸的产生，这是由于CadA(从土曲霉基因cad1表达的蛋白质被称为CadA)的不溶性聚集体的形成导致其功能丧失(Yamamoto等人Bioengineered.20156(5):303-6)。据报道，通过在20℃或28℃下生产衣康酸(大肠杆菌细胞生长较差)，或者使用两步法，其中首先在37℃下产生生物质，然后在28℃下生产衣康酸，至少部分地避免了这一问题(Harder等人BiotechnolBioeng.2018.115(1):156-164.)。另外，当异源表达时，cad1似乎是一个瓶颈。据报道，仅含有cad1的大肠杆菌菌株产生相对低的量(80ppm衣康酸过夜)(Li等人FungalGenetBiol.201148(6):602-11)。而且，从含有诱导型启动子诸如PLAC或PBAD的载体表达cad1不能产生足够水平的cad1，这表明需要强启动子(Yamamoto等人Bioengineered.20156(5):303-6)。继续尝试解决这些限制问题，并且包括过表达cad1的多个拷贝(Kim等人SciRep.20177:39768)并从更强和/或组成型载体表达cad1(Yamamoto等人Bioengineered.2015.6(5):303-6；Harder等人MetabEng.201638:29-37)。据报道，通过缺失icd中断异柠檬酸脱氢酶活性导致大肠杆菌中的生长缺陷或对谷氨酸的营养缺陷型(Okamoto等人JGenApplMicrobiol2014.60(5):191-7、Yamamoto等人Bioen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，所述方法包括：/n获得能够产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体；/n改变所述生物体；以及/n通过改变的所述生物体产生与未改变的所述生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180201 US 62/624,874;20180706 US 62/694,6021.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，所述方法包括：
获得能够产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体；
改变所述生物体；以及
通过改变的所述生物体产生与未改变的所述生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物体是钩虫贪铜菌或具有与其相似特性的生物体。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物体被改变以表达下述的两种或更多种：顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。


5.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。


6.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶来自土曲霉。


7.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶包含SEQIDNO:1或表现出与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。


8.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶由包含SEQIDNO:2的核酸序列或表现出与SEQIDNO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。


9.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶来自谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌。


10.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶包含SEQIDNO:3或5或表现出与SEQIDNO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。


11.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶由包含SEQIDNO:4、6或7的核酸序列或表现出与SEQIDNO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。


12.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶来自钩虫贪铜菌。


13.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶包含SEQIDNO:8或10或表现出与SEQIDNO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。


14.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶由包含SEQIDNO:9或11的核酸序列或表现出与SEQIDNO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。


15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。


16.根据权利要求15所述的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。


17.根据权利要求15所述的方法，其中消除了基因icd1和/或icd2。


18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被调节以减少衣康酸的降解。


19.根据权利要求18所述的方法，其中编码归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc的基因被下调、缺失或突变。


20.根据权利要求18所述的方法，其中表5中鉴定的基因被下调、缺失或突变。


21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被进一步改变以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。


22.根据权利要求8、11或14所述的方法，其中所述核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。


23.一种与未改变的生物体相比能够产生更多的参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的改变的生物体。


24.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体是钩虫贪铜菌或具有与其相似特性的生物体。


25.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶。


26.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶中的两种或更多种。


27.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶。


28.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶来自土曲霉。


29.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶包含SEQIDNO:1或表现出与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。


30.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶由包含SEQIDNO:2的核酸序列或表现出与SEQIDNO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。


31.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶来自谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌。


32.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶包含SEQIDNO:3或5或表现出与SEQIDNO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。


33.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶由包含SEQIDNO:4、6或7的核酸序列或表现出与SEQIDNO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。


34.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述乌头酸水合酶来自钩虫贪铜菌。


35.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述乌头酸水合酶包含SEQIDNO:8或10或表现出与SEQIDNO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。

【专利技术属性】
技术研发人员：埃米莉·苏菲·弗里奇，亚历山大·布雷特·福斯特，
申请(专利权)人：英威达纺织英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB