一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法技术

一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法，本发明专利技术制备抗胰岛素原前体蛋白（PPI）抗体，在此基础上建立双抗体夹心ELISA，为重组人胰岛素中PPI的检测方法的确立奠定基础。本发明专利技术可用于重组人胰岛素生产的过程控制和产品放行控制。

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法
本专利技术属于重组人胰岛素中的胰岛素原前体蛋白的检测
，涉及一种胰岛素原前体蛋白的检测方法及其PPI单克隆抗体的制备方法，特别涉及一种双抗夹心ELISA的建立方法及其PPI单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
胰岛素参与调节糖代谢，控制血糖平衡是临床上用于治疗糖尿病的主要药物。现在临床常用的胰岛素多是采用重组DNA技术将含胰岛素DNA的质粒植入大肠杆菌或酵母菌中大量表达形成非活性的胰岛素原前体蛋白(Pre-proinsulin，PPI)，再经酶切、纯化，得到高纯度胰岛素。PPI的高效、稳定表达是获得高产率胰岛素的前提条件，但未被酶切、去除的PPI会严重影响胰岛素的质量安全。因此对PPI表达量进行测定，并对酶切、纯化过程中以及胰岛素中PPI残留量进行检测和控制具有非常重要的意义。欧洲药典明确指出要对胰岛素中PPI进行检测和控制，但未对检测方法做出具体要求。目前，常用的方法主要有放射性免疫分析法、高效液相色谱法等。放射性免疫分析法因价格昂贵、容易造成环境污染、危害人体健本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PPI单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：用胰岛素原前体蛋白作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价高的小鼠于细胞融合前3 天经腹腔注射免疫原胰岛素原前体蛋白100μg/只加强免疫；之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞；将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株；将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×10

【技术特征摘要】
1.一种PPI单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：用胰岛素原前体蛋白作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；初次免疫剂量为100μg/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫两周后，检测血清抗体效价，选效价高的小鼠于细胞融合前3天经腹腔注射免疫原胰岛素原前体蛋白100μg/只加强免疫；之后眼球取血处死，分离免疫脾细胞；将免疫脾细胞和已经制备好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；ELISA筛选阳性单克隆杂交瘤细胞，经3次亚克隆及ELISA检测完全阳性后，扩大培养并建株；将筛选出的稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞以1～5×106个/只的数量接种于已经腹腔注射弗氏不完全佐剂6～8周龄的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感时，用10ml针头采集腹水；将腹水离心，收集上清，用ProteinG凝胶柱进行纯化，得到纯化后的PPI单克隆抗体。


2.一种胰岛素原前体蛋白的检测方法，其特征在于：包括将权利要求1制得的纯化后的PPI单克隆抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至1ug/ml，100ul/孔包被于酶标板中，每孔分别添加150ul的质量分数为2%的BSA溶液，37℃封闭60min，PBST洗涤3次；于检测孔加100ul的浓度为1ug/ml的胰岛素原前体蛋白水溶液，以质量浓度为1%的BSA溶液作为空白对照，37℃放置60min，PBST洗涤3次；按棋盘法排布，检测孔和空白对照分别加生物素标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱珠，张小倩，亓振国，方美姑，王长凤，赵雨，周伟，路江杰，熊爱军，
申请(专利权)人：合肥天麦生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34