一种快速、特异性测定RNA含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速、特异性测定RNA含量的方法。该方法使用特异性染料SYTO

【技术实现步骤摘要】
一种快速、特异性测定RNA含量的方法
本专利技术涉及一种快速、特异性测定RNA含量的方法，属于生物

技术介绍
RNA是重要的生物分子，负责许多功能，其中包括物理传递、遗传信息解释、分子机器的结构支持以及基因表达的调控等。在生物样品和活细胞中定量RNA具有非常重要的作用。现有的RNA检测方法包括紫外吸收光谱法和地衣酚比色法，前者利用RNA在260nm处有最大吸收峰对核酸进行定量，而后者是利用在酸性环境下，核糖发生降解成糠醛，利用地衣酚和糠醛显色对糠醛定量，从而间接的对RNA进行定量。此外，定磷法也经常用于核酸类物质的检测，主要利用核酸中的磷与钼酸的显色反应来实现核酸物质的定量。但是这几种方法无法避免生物样品中其他物质的干扰，比如蛋白质、DNA类物质对于紫外吸收法测定RNA会有较大干扰，核糖类物质对地衣酚法以及其他含磷物质如磷酸盐对定磷法检测的干扰等。近年来，由于荧光的灵敏度高，检测快速，通量高的优点，核酸的荧光测定已经得到了广泛的发展。最常用的用于核酸检测的荧光染料是Hochest33258，但是Hochest33258是一种能够同时结合DNA和RNA的非特异性染料，因此在测定的样品中含有DNA时，需要先用RNA酶降解RNA，先对样品中的DNA进行定量，之后再RNA定量时减去样品中的DNA含量，此方法操作过程繁琐费时，增加了实验中的误差。因此需要开发出一种快速、特异性测定RNA含量的方法，排除RNA定量过程中杂质的干扰，提高RNA定量的准确性，同时简化操作，提高效率。专利技术内容有鉴于此，本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、特异性测定RNA含量的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下方案实现：本专利技术提供一种测定RNA含量的方法，将RNA特异性染料与RNA样品混合孵育，通过测定荧光强度计算RNA的含量。在本专利技术的一种实施方式中，所述RNA样品中还含有DNA、酚类、醇类物质、蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述RNA样品中的RNA含量至少为2μg/mL在本专利技术的一种实施方式中，所述RNA特异性染料为SYTOTMRNASelectTMGreenFluorescentcellStain。在本专利技术的一种实施方式中，所述RNA特异性染料的浓度为5～10μmol/L。在本专利技术的一种实施方式中，利用酶标仪测量荧光强度，测量条件为激发波长400～500nm，发射波长500～600nm。在本专利技术的一种实施方式中，孵育时间为2～7min。在本专利技术的一种实施方式中，测定总时间不超过10min。本专利技术提供一种特异性测定RNA的方法，向待测样品中加入RNA特异性染料，荧光强度计算RNA的含量；在激发波长400～500nm，发射波长500～600nm的条件下检测荧光；检测结果具有荧光反应即为样品中含有RNA。在本专利技术的一种实施方式中，所述RNA样品中还含有DNA、核糖、磷酸盐和/或蛋白质。在所述RNA样品中还含有DNA、核糖、磷酸盐和/或蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述DNA的浓度不低于2μg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，核糖的浓度不低于0.6μg/mL；所述磷酸盐的浓度不低于0.6μg/mL；所述蛋白质的浓度不低于0.6μg/mL。本专利技术还保护所述方法在测定RNA中的应用。本专利技术的优点：本专利技术所提供的测定RNA的方法，可以通过SYTOTMRNASelectTM染料与样品的混合，再利用酶标仪快速测定荧光强度，根据标准曲线即可得到对应的RNA含量，快速、简便。对于RNA的纯度要求较低，能够在含有多种杂质的环境中特异性与RNA进行结合，并准确测定其含量；且在低浓度RNA(2μg/mL)时，也能准确测定其含量。且检测时间短，对于快速、特异性测定RNA含量具有重要意义。附图说明图1为本专利技术检测方法的流程示意图。图2为SYTOTMRNASelectTM检测不同浓度RNA的荧光强度。图3为荧光强度与RNA浓度的标准曲线。图4为SYTOTMRNASelectTM与Hoechst33255对不同RNA样品荧光定量结果。图5为样品中含有其他杂质的RNA检测结果。图6为紫外分光光度法、地衣酚法和SYTOTMRNASelectTM法检测RNA含量的比较结果。具体实施方式一、材料和设备RNA标准品(sigma)：酵母单链rRNADNA标准品(sigma)：鲑鱼精DNAPBS缓冲液(1L)：NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24gRNA染料(ThermoFisher)：SYTOTMRNASelectTMGreenFluorescentcellStainRNA染料(sigma)Hoechst33258酶标仪SynergyH4/Elx800(BioTek)黑色平底微孔板(96孔)(Corning3603)二、标准曲线的制作1、精确称量RNA标准品，超纯水稀释至合适的浓度，制备成特定浓度的RNA标准溶液。2、分别吸取不同体积RNA储备液加入到微孔板中，然后用去离子水补足至100uL，每个梯度2个平行。3、SYTOTMRNASelectTMGreenFluorescentCellStain染料用PBS溶液稀释至浓度为合适的浓度，吸取一定体积的染液到孔板中与样品混匀。4、将反应体系放置暗处避光静置5min。实施例1：SYTOTMRNASelectTM最适浓度探究1、用PBS缓冲液将SYTOTMRNASelectTM分别稀释500，1000，2000，5000倍，分别制成10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1μmol/L储液浓度的染液，4℃放置备用。2、精确称取RNA标准品10mg，定容至100mL，得到100mg/L的RNA标准溶液。3、分别吸取2，5，10，15，20，25，30，35，40，50μLRNA标准溶液至黑色96微孔板中，加入去离子水，补足至100μL，每个梯度两个平行。4、吸取100μL第1步中制备的不同浓度的染液，分别与上述RNA样品混合，避光孵育5min，置于酶标仪SynergyH4/Elx800(BioTek)中以超纯水作为对照，测定荧光，其中激发光为490nm，发射光为530nm。5、测得的荧光强度减去空白，使用矫正的数据对RNA浓度与荧光强度进行线性拟合(图2)。如图，随着SYTOTMRNASelectTM浓度的上升，RNA浓度与荧光强度的线性关系逐渐上升，当SYTOTMRNASelectTM浓度在10μmol/L时，线性关系良好，R2＝0.9965。结合实验成本和线性关系结果，染料的浓度最优为10μmol/L。实施例2：RNA浓度—荧光强度标准曲线1、精确称取RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定RNA含量的方法，其特征在于，将RNA特异性染料与RNA样品混合孵育，通过测定荧光强度计算RNA的含量；所述RNA特异性染料为SYTO

【技术特征摘要】
1.一种测定RNA含量的方法，其特征在于，将RNA特异性染料与RNA样品混合孵育，通过测定荧光强度计算RNA的含量；所述RNA特异性染料为SYTOTMRNASelectTMGreenFluorescentcellStain。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA样品中的RNA含量至少为1μg/mL。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA特异性染料的浓度为5～10μmol/L。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用酶标仪测量荧光强度，测量条件为：激发波长400～500nm，发射波长500～600nm。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，孵育时间为2～7min。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，李江华，伍业旭，卢川川，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32