一种Fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测引物组合物及其应用。该LAMP检测引物组合物由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸、序列表中序列4所示的核苷酸、序列表中序列5所示的核苷酸和序列表中序列6所示的核苷酸组成。本发明专利技术的检测方法简便易行、实用性好、灵敏度高、特异性强、准确性高、实现了恒温扩增，同时还为fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的检测提供了新的技术平台，可用于fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的高灵敏度快速检测，同时能够对辣椒疫霉的fluoxapiprolin抗性群体进行检测，及时了解抗性群体发展动态，本发明专利技术对作物辣椒疫病的抗药性治理和科学指导用药，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种Fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种fluoxapiprolin(BCS-CS55621)抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
技术介绍
辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)是一类重要的植物病原卵菌，其寄主广泛，能够侵染茄科、豆科、葫芦科等植物并造成毁灭性的灾害。在温暖潮湿的环境条件下，辣椒疫霉侵染寄主引起的病害具有爆发性的特点，给其防治带来了困难。目前，生产上主要使用杀菌剂防治辣椒疫霉引起的植物病害。fluoxapiprolin是拜耳作物科学公司研发的新药剂，开发代码BCS-CS55621，其分子结构与杜邦的氟噻唑吡乙酮非常相似，靶标为氧化固醇结合蛋白(OSBP)，对晚疫病、霜霉病、根腐病、茎腐病、疫病等在内的卵菌纲病害表现出卓越的防效。病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的抗性菌株的检测方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药平板上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性，该方法检测周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，PCR技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂，不能满足快速检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。环介导等温扩增反应(LAMP)是日本学者Notomi等专利技术的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。在LAMP的反应过程中，DNA聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变PH值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；通过肉眼即可判定结果；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，及适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。该技术在植物病原菌抗药性基因型检测报道很少，目前国内外尚未有辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型G700V的LAMP快速分子鉴定的相关报道。
技术实现思路
植物病原微生物在农药的长时间胁迫压力下，会产生抗性，发现其产生抗性的机理，对植物病害的防治具有非常重要的意义。本专利技术的专利技术人在长期的植物病害抗药性的研究中发现辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗药性菌株主要是靶标蛋白PcORP1第700位氨基酸密码子突变造成，第700位氨基酸密码子GGA(Gly)→GTA(Val)的突变对fluoxapiprolin表现出高抗。这对研究病原的抗性机制和病害防控具有非常重要的意义。基于此，专利技术目的：提供一种一种辅助鉴定辣椒疫霉是否产生对fluoxapiprolin的抗型的方法，是检测辣椒疫霉中的基因型是否为fluoxapiprolin抗性基因型G700V，所述fluoxapiprolin抗性基因型G700V为辣椒疫霉基因组中的GenBankAccessionVertionnumber为BT031593.1所示的基因，自5’端第2103位核苷酸由G突变为T,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子GGA(Gly)→GTA(Val)的突变。由于检测该位点存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点。本专利技术在抗药性机制研究的基础上，进一步提供一种fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。通过对辣椒疫霉的序列分析，设计了可特异性区分不同的抗性基因型的LAMP引物，基于LAMP技术能快速、准确鉴定辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型G700V。该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏度高等特点，能大大提高检测效率，对辣椒疫病的抗药性治理、监测及抗药性流行预警具有重要的现实意义。本专利技术所述的辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型G700V是指辣椒疫霉fluoxapiprolin的靶标蛋白PcORP1(GenBank:BT031593.1所示的基因编码的蛋白质)第700位氨基酸密码子突变造成对fluoxapiprolin表现出高抗，即自GenBankAccessionVertionnumber为BT031593.1的5’端第2103位核苷酸由G突变为T,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子GGA(Gly)→GTA(Val)的突变，从而表现出对fluoxapiprolin表现出高抗。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种用于检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF和环引物LB组成，各引物序列具体如下：FIP：5′-GACTGGTATGTTTCGCCCAGGAGACTGCACCACAGTATCAT-3′(序列表中序列1)；BIP：5′-TGTGAACACACGAGCCACCA-GCACAAACCCAGCAATGGA-3′(序列表中序列2)；F3：5′-AGCGCTTCAAGTACGTAGTG-3′(序列表中序列3)；B3：5′-TGACGCTCATACTGGCATG-3′(序列表中序列4)；LF：5′-CGGGTTGAATGGTTTCAGCT-3′(序列表中序列5)；LB：5′-CCCACCTATCAGTAACTTCCAGTTC-3′(序列表中序列6)。本专利技术还提供一种检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测试剂盒，包括上述的LAMP引物组合物。所述LAMP检测试剂盒中，还包括PCR反应试剂。所述的检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物组合物或者所述的LAMP检测试剂盒在检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测方法。本专利技术提供的检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测方法，包括下述步骤：提取待检辣椒疫霉的DNA，以提取的DNA为模板，利用上述LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物若从粉色变为黄色，且进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，若存在梯状条带，则证明所检测辣椒疫霉为fluoxapiproli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测引物组合物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸、序列表中序列4所示的核苷酸、序列表中序列5所示的核苷酸和序列表中序列6所示的核苷酸组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测引物组合物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸、序列表中序列4所示的核苷酸、序列表中序列5所示的核苷酸和序列表中序列6所示的核苷酸组成。


2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉中的应用。


3.一种检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测试剂盒，包括权利要求1所述的LAMP检测引物组合物；
优选的，所述LAMP检测试剂盒中还包括PCR反应试剂。


4.权利要求3或4所述的试剂盒在检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉中的应用。


5.一种辅助鉴定辣椒疫霉是否产生对fluoxapiprolin的抗型的方法，是检测辣椒疫霉中的基因型是否为fluoxapiprolin抗性基因型G700V，所述fluoxapiprolin抗性基因型G700V为辣椒疫霉基因组中的GenBankAccessionVertionnumber为BT031593.1所示的基因，自5’端第2103位核苷酸由G突变为T,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子GGA(Gly)→GTA(Val)的突变。


6.一种检测fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP检测方法，包括下述步骤：
1)提取待测辣椒疫霉的DNA；
2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP检测引物组合物或权利要求3或4所示的LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物若从粉色变为黄色，且进行琼脂糖凝...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，苗建强，李成成，刘小飞，高续恒，李桂香，张西涛，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61