一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法，所述的方法包括引物设计，重组质粒构建，标准曲线制作，灵敏度检测，重复性检测以及样品检测。检测的具体步骤为：称取土样，提取土壤微生物的总DNA，用引物Sps‑1和Sps‑2对粉痂菌ITS区域进行PCR扩增，产物回收后连接到pMD18‑T载体上，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆，用碱裂解法提取质粒；根据A260值计算质粒浓度，取新实验样品，比对试验结果在直线方程中的值。本检测方法在普通PCR基础上加入了一个探针，加快了检测速度，还并提高了检测的灵敏度和准确度，解决了由于马铃薯马铃薯粉痂菌不能人工培养，难以检测的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法
本专利技术涉及动植物保护领域，特别涉及是一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法。
技术介绍
目前国内没有该技术在马铃薯粉痂菌检测中的应用研究，国外目前有研究使用TaqMan探针进行多重实时PCR检测薯块中粉痂菌，但在土壤检测中存在一定问题，探针特异性不准确。植物病害的有效防治措施取决于对病害和病原体的正确识别，但马铃薯粉痂菌因不能人工离体培养，对其薯块及土壤中病原菌的存在与含量均不能准确得知，造成病害防控难度增大；而且在症状上该病害容易与马铃薯疮痂病混淆，而两种病害的防控措施完全不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法，包括如下步骤：(1)称取土样0.2g、直径约2mm的石英砂0.2g加入1.5mL的离心管中，混匀；(2)加入400μL4％脱脂牛奶悬浮液，500μLDNA提取缓冲液100mmoL/LTris，pH8.0；100mmoL/LEDTA；250mmoL/LNaCl，100μL10％SDS，75μL5moL/LNaCl，65μL10％CTAB，在旋涡振荡仪上振荡1min，加入100μLTris-饱和酚，旋涡振荡仪上振荡30s；(3)将离心管放置于65℃水浴锅中水浴45min，其间轻轻摇动离心管。取出离心管12000r/min室温离心10min，将上清转到一新的离心管中，加入等体积的水饱和酚，混匀10min，12000r/min离心10min；(4)取上清加入0.6倍体积的冰异戊醇，-20℃沉淀1h或过夜；(5)12000r/min离心10min，弃上清留沉淀，用75％乙醇洗沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，风干后溶于20μLTE中，-20℃保存备用；(6)以土壤总DNA为模板，用引物Sps-1和Sps-2对粉痂菌ITS区域进行PCR扩增，PCR产物经UNIQ-10柱式PCR纯化试剂盒回收后，连接到pMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，涂布含Amp的平板，筛选阳性克隆，用碱裂解法提取质粒，进行序列测定并进行序列比较分析；(7)测定质粒A260和A280值，A260和A280比值在1.8～2.0的质粒方可用于建立标准曲线。根据A260值计算质粒浓度，以10倍系列稀释的质粒为模板在OpticonTM2型RealtimePCR仪上扩增，制作标准曲线，反应结束后，利用MJOpticonMonitorTMVerson3.1分析软件自动得到标准曲线；(8)通过基线设定，系统自动生成标准曲线和直线回归方程，由标准曲线、起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系，直线回归方程的相关系数达到0.999，直线回归方程为Y＝-2.292X+14.250；(9)取新实验样品，重复上述步骤，比对试验结果在直线方程中的值。优选地，在步骤(6)中，其中反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火25s，72℃延伸30s，30个扩增循环；72℃10min。优选地，在步骤(7)中，在A260和A280下测得的A值分别为1.1229和0.5708，A260/A280比值为1.97，介于1.8～2.0之间，根据公式计算出重组质粒的浓度为5.6145mg/mL。本专利技术的技术效果和优点：本专利技术可准确判断马铃薯粉痂病的危害，可以准确检测土壤中粉痂菌的含量，方便快捷，检测的灵敏度为4.7pg/μL，比常规PCR灵敏度高100倍，并且具有较好的重复性操作性。附图说明图1为本专利技术的实时PCR扩增动态曲线图；其中，横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为反应过程中检测到的荧光信号值1-5为质粒的5个稀释浓度，分别为5.61×102ng/μL、5.61×10ng/μL、5.61ng/μL、5.61×10-1ng/μL、5.61×10-2ng/μL。图2为本专利技术实时荧光PCR检测6个不同浓度的德宏陇川县土壤粉痂菌样品；其中，值横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为反应过程中检测到的荧光信号1-6分别为不同稀释倍数的土壤样品，浓度为47ng/μL、4.7ng/μL、4.7×10-1ng/μL、4.7×10-2ng/μL、4.7pg/μL和4.7×10-1pg/μL。图3为本专利技术常规PCR检测灵敏度对比图；其中，M:DNAmarkerDL2000；1-6为不同浓度的德宏陇川县土壤粉痂菌样品，分别为47ng/μL、4.7ng/μL、4.7×10-1ng/μL、4.7×10-2ng/μL、4.7pg/μL和4.7×10-1pg/μL图4为本专利技术实时PCR检测样品重复性动态图；其中，横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为反应过程中检测到的荧光信号值。图5为本专利技术实时PCR检测样品重复性标准曲线。图6为本专利技术的实时PCR检测未知样品的动态图。图7为本专利技术的实时PCR定量检测样品标准曲线其中，1-5为标准品1-5号；6-9为未知样品1-4号；10为对照具体实施方式以下通过实施例进一步说明本专利技术。应该理解的是，这些实施例是本专利技术的阐释和举例，并不以任何形式限制本专利技术的范围。试验例一、实验原理引物的设计与合成实时荧光PCR采用引物SsTQF1(5-CCGGCAGACCCAAAACC-3)、SsTQR1(5-CGGGCGTCACCCTTCA-3)和Taq探针ProbeSsTQP1(5-CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG-3)，常规PCR采用引物Sps-1(5-CCGGCAGACCCAAAACC-3)和Sps-2(5-CACGCCAATGGTTAGAGACG-3)。二、实验步骤2.1土壤微生物总DNA的提取(1)称取土样0.2g、直径约2mm的石英砂0.2g加入1.5mL的离心管中，混匀。(2)加入400μL4％脱脂牛奶悬浮液，500μLDNA提取缓冲液(100mmoL/LTris，pH8.0；100mmoL/LEDTA；250mmoL/LNaCl)，100μL10％SDS，75μL5moL/LNaCl，65μL10％CTAB，在旋涡振荡仪上振荡1min。加入100μLTris-饱和酚，旋涡振荡仪上振荡30s。(3)将离心管放置于65℃水浴锅中水浴45min，其间轻轻摇动离心管。取出离心管12000r/min室温离心10min。将上清转到一新的离心管中，加入等体积的水饱和酚，混匀10min，12000r/min离心10min。(4)取上清加入0.6倍体积的冰异戊醇，-20℃沉淀1h或过夜。(5)12000r/min离心10min，弃上清留沉淀，用75％乙醇洗沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，风干后溶于20μLTE中，-20℃保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)称取土样0.2g、直径约2mm的石英砂0.2g加入1.5mL的离心管中，混匀；/n(2)加入400μL4％脱脂牛奶悬浮液，500μLDNA提取缓冲液100mmoL/L Tris，pH8.0；100mmoL/LEDTA；250mmoL/L NaCl，100μL 10％SDS，75μL 5moL/LNaCl，65μL 10％CTAB，在旋涡振荡仪上振荡1min，加入100μLTris-饱和酚，旋涡振荡仪上振荡30s；/n(3)将离心管放置于65℃水浴锅中水浴45min，其间轻轻摇动离心管。取出离心管12000r/min室温离心10min，将上清转到一新的离心管中，加入等体积的水饱和酚，混匀10min，12000r/min离心10min；/n(4)取上清加入0.6倍体积的冰异戊醇，-20℃沉淀1h或过夜；/n(5)12000r/min离心10min，弃上清留沉淀，用75％乙醇洗沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，风干后溶于20μLTE中，-20℃保存备用；/n(6)以土壤总DNA为模板，用引物Sps-1和Sps-2对粉痂菌ITS区域进行PCR扩增，PCR产物经UNIQ-10柱式PCR纯化试剂盒回收后，连接到pMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，涂布含Amp的平板，筛选阳性克隆，用碱裂解法提取质粒，进行序列测定并进行序列比较分析；/n(7)测定质粒A...

【技术特征摘要】
1.一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取土样0.2g、直径约2mm的石英砂0.2g加入1.5mL的离心管中，混匀；
(2)加入400μL4％脱脂牛奶悬浮液，500μLDNA提取缓冲液100mmoL/LTris，pH8.0；100mmoL/LEDTA；250mmoL/LNaCl，100μL10％SDS，75μL5moL/LNaCl，65μL10％CTAB，在旋涡振荡仪上振荡1min，加入100μLTris-饱和酚，旋涡振荡仪上振荡30s；
(3)将离心管放置于65℃水浴锅中水浴45min，其间轻轻摇动离心管。取出离心管12000r/min室温离心10min，将上清转到一新的离心管中，加入等体积的水饱和酚，混匀10min，12000r/min离心10min；
(4)取上清加入0.6倍体积的冰异戊醇，-20℃沉淀1h或过夜；
(5)12000r/min离心10min，弃上清留沉淀，用75％乙醇洗沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，风干后溶于20μLTE中，-20℃保存备用；
(6)以土壤总DNA为模板，用引物Sps-1和Sps-2对粉痂菌ITS区域进行PCR扩增，PCR产物经UNIQ-10柱式PCR纯化试剂盒回收后，连接到pMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，涂布含Amp的平板，筛选阳性克隆，用碱裂解法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘霞，杨艳丽，黄勋，钱红洁，张哲，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53