一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示。本发明专利技术研究发现位于4329/4330bp的功能SNP位点GC/TT以及位于启动子区域‑741bp处9个碱基缺失与碱消值相关，会影响支链淀粉的侧链结构，因此获得最优的ALK等位基因，开发快速、准确、检测成本低的功能标记是开展碱消值分子设计育种的重要保障和途径。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法。
技术介绍
水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，是全球一半以上人口赖以生存的基本食粮。然而随着经济的发展，城镇化进程的持续推进，我国国民生活水平的不断改善，消费者对稻米品质的要求也与日俱增。水稻品质改良育种是适应当前市场的迫切需求，已经成为最主要的育种改良目标之一。根据农业农村部颁布的米质评价标准，主要包括糙米率、整精米率、垩白度、透明度、碱消值、胶稠度、支链淀粉。碱消值已经是仅次于垩白度的评价水稻品质的重要指标，直接与蒸煮食味品质相关，低碱消值是限制优质杂交水稻选育的重要限制因素(Gaoetal.2003,Gaoetal.2011,Yuetal.2011)。碱消值是由一个主效基因控制，多个微效基因共同调控的复性状。在水稻育种选育过程中，难以通过常规的方法进行选择，而且其测定方法较为复杂。而现有分子标记筛选方法则是存在成本高，特异性较差的问题。通过优良种质资源筛选与鉴定，设计目标基因优良单倍体型的功能标记，在较早世代开展分子标记选择，鉴定不同的等位基因型，有利于开展稻米品质改良育种。因此，亟需设计一种特异性好，且成本低的筛选方法。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法，本申请通过对片段代换系群体的大量筛选，获得了一个水稻碱消值优异的资源材料及其ALK等位基因的分子标记方法。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测水稻碱消值的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2和/或SEQIDNO.3～4所示，具体序列如下：ZT125F：ACTAGCGACTATGGTTTGTG；(SEQIDNO.1)ZT125R：ATACAGGTAGAATGGCAGTG；(SEQIDNO.2)ZT140F：GAGCCGTGCGGCCTCAACCA；(SEQIDNO.3)ZT140R：CCTGCGACATGCCGCGCACCTGGAT；(SEQIDNO.4)其中，ZT125F/R用于鉴定启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异；ZT140F/R用于鉴定第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT差异。可以以ZT125F/R或ZT140F/R单独作为分子标记，也可以将两者结合起来一同作为分子标记使用。一种检测水稻碱消值的分子标记方法，包括以下步骤：(1)采用CTAB法提取待测水稻DNA；(2)用权利要求2所述引物对水稻DNA进行PCR扩增，分别获得包含ALK基因启动子和第8外显子的相应片段；(3)酶切含有第8外显子的扩增产物，然后分别对酶切产物和包含ALK基因启动子的扩增产物进行电泳检测，经条带分析辨别对应水稻材料ALK基因型。进一步地，PCR反应体系为10μL2×PCRmix、2μL10mM前引物、2μL10mM后引物、2μL模板DNA，4μLddH2O。进一步地，PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃退火30s；共32个循环，72℃延伸5min；4℃延伸1min。一种用于检测水稻碱消值的试剂盒，包括上述引物。上述分子标记在改良水稻碱消值培育优质水稻品种中的应用。一种用于改良水稻碱消值培育优质水稻的基因芯片，包括上述分子标记。本专利技术的有益效果为：鉴定到了改良水稻碱消值的优异种质资源，同时开发ALK优异等位基因的分子标记方法及其专用dCAPS引物。相比之前开发的dCAPS引物，常用限制性内切酶BamHⅠ的使用可准确、低成本的检测水稻品种或育种材料中ALK基因的等位基因类型，便于ALK优异等位基因在水稻育种上的应用。本专利技术研究发现位于4329/4330bp的功能SNP位点GC/TT以及启动子区域-741bp处9个碱基缺失与碱消值相关，会影响支链淀粉的侧链结构。因此获得最优的ALK等位基因，开发快速、准确、检测成本低的功能标记是开展碱消值分子设计育种的重要保障和途径。附图说明图1为ALK基因-741bp处9个碱基缺失导致启动子活性降低；图2为Q1182植株农艺性状表型；图3为启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异PCR扩增示意图及部分核心种质资源PCR产物凝胶电泳图；图4为第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TTPCR产物酶切示意图及部分核心种质资源凝胶电泳图。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1检测启动子-741bp处9个碱基缺失对ALK启动子活性的影响首先通过QPCR对获得的碱消值优异资源材料Q1882以及其对照水稻品种R498受精后15天的颖果中ALK的表达量开展检测。包括以下步骤：(1)颖果RNA提取：RNA提取采用TRIzol试剂提取(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；(2)cDNA合成：依照SuperScriptII(Invitrogen)cDNA合成试剂盒开展；(3)qPCR定量检测RNA：qPCR反应通过qTOWER3GReal-TimeSystem定量PCR分析仪开展(AnalytikJena,Germany)，使用ALK基因内部特异的引物。其结果见图1，实验结果表明9个碱基缺失降低了ALK的转录水平图。ALK基因起始密码子上游1.58kb的启动子片段分别从Q1882及对照水稻品种R498中扩增出来，并进一步构建到luciferase(firefly,Photinuspyralis)报告质粒中(Pcambia1300-35S-LUC)；构建好的质粒与含有35S启动子启动的Renillain报告质粒(Pcambia1300-35S-RLUC)同时在烟草中瞬时表达，转化的烟草在放置24小时后，通过Biorad成像系统拍照，同时荧光素酶活性通过BeyotimeDualLuciferaseReporterGene检测试剂盒测定，实验按照说明书的步骤进行，其结果见图1。如图1所示，图中A为R498与片段代换系Q1882受精后15天颖果中ALK的表达量检测及成熟种子品质性状检测；B为R498与Q1882型ALK启动子启动荧光素酶活性检测；C为B荧光素酶活性的定量数据，其R498启动子活性高于Q1882型；根据图1的检测结果可知，9个碱基缺失降低了ALK的启动子的活性。实施例2优异种质资源Q1882鉴定与主要农艺性状考察种质资源Q1882鉴定，包括以下步骤：1、启动子区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测水稻碱消值的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水稻碱消值的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2和/或SEQIDNO.3～4所示。


2.一种检测水稻碱消值的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻DNA；
(2)用权利要求1所述的分子标记对水稻DNA进行PCR扩增，获得包含ALK基因启动子和/或第8外显子的相应片段；
(3)酶切含有第8外显子的扩增产物，然后分别对酶切产物和包含ALK基因启动子的扩增产物进行电泳检测即可。


3.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10μL2×PCRmix、2μL1...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂斌，郑灵，李仕贵，马炳田，王玉平，钦鹏，刘品，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51