【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药发酵领域，具体涉及一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法。
技术介绍
1、雷帕霉素（rapamycin）是由吸水链霉菌（ strepomyces hygroscopicus）发酵产生的一种33元大环内酯类免疫抑制剂，因其具有低毒高效的特点（较环孢菌素），1999年被美国食品和药物管理局（fda）批准为肾移植的免疫抑制药物（商品名为rapamune）。此外，近年来研究还发现雷帕霉素具有免疫抑制、抗真菌、抗炎症、抗癌症、抗动脉粥样硬化、神经保护和抗衰老等多种生物活性。因此，雷帕霉素具有广阔的临床应用前景和较高的市场价值。
2、作为一种典型的次级代谢产物，雷帕霉素生物合成十分复杂，且受到胞内多种代谢调控体系的调节。目前，国内外针对雷帕霉素发酵产量的提升已开展了多方面的工作，主要包括培养基与发酵工艺优化、菌株物理和化学诱变、菌株基因工程改造等策略。尽管上述方法在一定程度上使得雷帕霉素的发酵产量得到有效提升，但其工作量大，且均面临菌株的稳定性差、回复突变率高、菌株易退化等问题。因此，如何建立快速激活雷帕霉素生物合成胞内代谢调控体系的发酵策略，将为雷帕霉素产量的提升提供一个新途径。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种外源添加化学激发剂策略，快速激活雷帕霉素合成的发酵方法，具体的化学激发剂种类及其添加策略如下：
2、① 本专利技术中涉及的化学激发剂种类包括：二甲基亚砜（c2h6os）、氯化钪（scc
3、② 化学激发剂浓度：二甲基亚砜：0.75%（v/v），氯化钪：75µmol/l，丁酸钠：75µmol/l；
4、③ 化学激发剂外源添加方法：配制上述化学激发剂溶液，采用无菌的针头滤器过滤后，在各分批发酵过程中于不同时间点分别加入上述1种无菌的化学激发剂溶液，其中丁酸钠添加时间为发酵后48h，二甲基亚砜添加时间为发酵后72h，氯化钪添加时间为发酵后96h。
5、作为本专利技术的技术特征，所采用的具体发酵操作步骤如下：
6、① 菌株的活化：将保存的菌株接种于固体试管斜面培养基，于28℃恒温培养10-14天；
7、② 液体种子培养：在250ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，灭菌后放至室温，用接种环在雷帕霉素固体斜面培养基上取1-2环菌种于液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h，获得种子液；
8、③ 液体发酵培养：在250ml三角瓶中装入50ml液体发酵培养基，灭菌后放至室温，按10-12%接种量接入种子液，于28℃、220rpm下恒温振荡培养7天。
9、其中，在液体发酵培养过程中，丁酸钠（75µmol/l）将于接入种子液48h后进行添加，并在相同条件下继续发酵120h；二甲基亚砜（0.75%，v/v）将于接入种子液72h后进行添加，并在相同条件下继续发酵至96h；氯化钪（75µmol/l）将于接入种子液96h后进行添加，并在相同条件下继续发酵72h。
10、上述步骤中所用培养基组成如下：
11、① 固体斜面培养基：燕麦粉20 g/l，酵母粉4 g/l，甘露醇2.5 g/l琼脂20 g/l，ph7.0
12、② 液体种子培养基：可溶性淀粉20 g/l, 葡萄糖20 g/l，玉米粉10 g/l，蛋白胨6g/l，酵母粉6 g/l，酪蛋白1.5 g/l，mgso4•7h2o 0.25 g/l，k2hpo4 1.0 g/l，ph 7.0
13、③ 液体发酵培养基：葡萄糖45 g/l，可溶性淀粉15 g/l，黄豆饼粉40 g/l， (nh4)2so4 1 g/l，k2hpo4 1 g/l，ph 7.0
14、作为本专利技术的技术特征，所述的吸水链霉菌（ strepomyces hygroscopicus ha12）为 strepomyces hygroscopicus atcc 29253经紫外诱变后筛选获得。
15、本专利技术经过上述发酵操作后，通过采用单独添加上述3种化学激发剂，雷帕霉素的最终产量较出发菌株（112.59 mg/l）产量可提升1.65-1.83倍。
16、
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1.一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法，其特征是在雷帕霉素发酵过程中，通过外源添加不同类型化学激发剂，雷帕霉素发酵产量快速提升。
2.如权利要求①所述方法，其特征外源添加的化学激发剂，包括二甲基亚砜、丁酸钠和氯化钪，且其最适添加浓度分别为0.75%（v/v）、75µmol/L和75µmol/L。
3.如权利要求①所述方法，外源添加3种化学激发剂的最优添加时间分别为雷帕霉素发酵接种后第48h（丁酸钠）、72h（二甲基亚砜）和96h（氯化钪）。
4.如权利要求①所述方法，上述外源添加二甲基亚砜的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48h后，接入无菌丁酸钠（75µmol/L）溶液，并在相同条件下继续发酵120h，结束发酵并测定雷帕霉素发酵产量。
5.如权利要求①所述方法，上述外源添加二甲基亚砜的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养
6.如权利要求①所述方法，上述外源添加氯化钪的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养96h后，接入无菌氯化钪（75µmol/L）溶液，并在相同条件下继续发酵72h，结束发酵并测定雷帕霉素发酵产量。
...【技术特征摘要】
1.一种快速激活雷帕霉素合成的发酵方法，其特征是在雷帕霉素发酵过程中，通过外源添加不同类型化学激发剂，雷帕霉素发酵产量快速提升。
2.如权利要求①所述方法，其特征外源添加的化学激发剂，包括二甲基亚砜、丁酸钠和氯化钪，且其最适添加浓度分别为0.75%（v/v）、75µmol/l和75µmol/l。
3.如权利要求①所述方法，外源添加3种化学激发剂的最优添加时间分别为雷帕霉素发酵接种后第48h（丁酸钠）、72h（二甲基亚砜）和96h（氯化钪）。
4.如权利要求①所述方法，上述外源添加二甲基亚砜的具体特征步骤如下：将在固体斜面培养基中活化的成熟菌株，采用接种环取1-2环至灭菌后的液体种子培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48-50h后，按10-12%（v/v）接种量接入灭菌后的液体发酵培养基中，于28℃、220rpm下恒温振荡培养48h后，接入无菌丁酸钠（75µmol/l）溶液，并在相同条件下继续发酵120h，结束发酵并测...
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