一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体采集与预处理；(2)消毒处理；(3)不定芽诱导；(4)增殖培养；(5)生根培养和(6)炼苗和移栽。采用本发明专利技术所述方法可以不受季节、温度和地域影响，可以生产大量的眼子菜无菌苗，通过对眼子菜休眠芽无菌繁殖体系的建立，并为后续实验室直接培育出眼子菜药用部位提供理论基础和技术支持；另外，还为以后对眼子菜进行系统的研究、湿地的保护与修复以及生态环境的修复具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法
本专利技术涉及的是属于植物组织培养
，具体地说是一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法。
技术介绍
眼子菜(PotamogetondistinctusA.BennettJ.Bot.)是眼子菜科(Potamogetonaceae)眼子菜属(Potamogeton)多年生水生草本植物，其根茎发达，白色，直径1.5-2毫米，多分枝，常于顶端形成纺锤状休眠芽体，并在节处生有稍密的须根。茎圆柱形，直径1.5-2毫米，通常不分枝。浮水叶革质，披针形、宽披针形至卵状披针形，长2-10厘米，宽1-4厘米，先端尖或钝圆，基部钝圆或有时近楔形，具5-20厘米长的柄；叶脉多条，顶端连接；沉水叶披针形至狭披针形，草质，具柄，常早落；托叶膜质，长2-7厘米，顶端尖锐，呈鞘状抱茎。穗状花序顶生，具花多轮，开花时伸出水面，花后沉没水中；花序梗稍膨大，粗于茎，花时直立，花后自基部弯曲，长3-10厘米；花小，被片4，绿色；雌蕊2枚（稀为1或3枚）。果实宽倒卵形，长约3.5毫米，背部明显3脊，中脊锐，于果实上部明显隆起，侧脊稍钝，基部及上部各具2凸起，喙略下陷而斜伸。眼子菜广布于我国南北大多数省区，主要生于池塘、水田和水沟等静水中。眼子菜俗称水上漂，又称水案板。特别是在各稻作区均有分布，主要依靠鸡爪芽（休眠芽）无性繁殖，常年造成危害。明代兰茂《滇南本草》中记载“牙齿草，又名牙拾草。生田中，味苦、涩，性寒。止赤白痢疾，大肠下血、妇人红崩漏下，恶血”。在《中药大辞典》中记载眼子菜具有清热利水、止血消肿、驱蛔的功效，眼子菜具有利尿、止血、杀虫等药理作用，用于治疗痔疮、蛔虫、水肿等病。前期研究表明眼子菜中含有黄酮类、挥发油类、氨基酸、糖类、鞣质及酚类等成分，具有一定药用价值。眼子菜也全草入药，采集时茎易断，难以收集大量药材。通过对安顺地区传统中医药调查发现：安顺地区（屯堡人）民族民间用其休眠芽（当地俗称“钉耙七”）治疗痔疮和肝炎效果较好，而眼子菜休眠芽主要是越冬休眠形成，在池塘、水田和水沟中难以采集。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对
技术介绍
中存在的问题，采用眼子菜休眠芽为外植体，在无菌条件下，通过组织培养技术，并在不经历愈伤组织培养阶段能直接出芽成苗，从而建立植物无菌苗体系，可大大缩短培养时间，能在短期内可获得大量无菌苗，其方法易行，操作方便，产量高，具体地说是一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体采集与预处理：选取长势健壮的眼子菜休眠芽作为外植体，先采用自来水直接冲洗1小时，并无菌纱布滤干；然后置于无菌操作台上，用浸泡75%乙醇的无菌脱脂棉擦拭1次，并去除多余芽鳞、不定根等附着物，再用无菌手术刀将丛生休眠芽单个从基部切断，将切成单个的休眠芽用无菌水反复冲洗4～5次,待用；(2)消毒处理：将步骤(1)中获得的眼子菜休眠芽，置于无菌操作台上先用75%酒精充分浸泡30～40s，再用0.1%升汞充分浸泡10min，取出后采用无菌水反复冲洗4～5次，在置入装有无菌水的玻璃杯中浸泡，待用；(3)不定芽诱导：将步骤(2)获得的无菌眼子菜休眠芽，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；(4)增殖培养：将步骤(3)诱导出的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，得到叶片颜色深绿，长势较好的眼子菜植株；(5)生根培养：将步骤(4)诱导出的眼子菜植株用无菌手术刀切分为单株，每株保留3～4片叶片；选择长势较好的眼子菜单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；(6)炼苗和移栽：将步骤(5)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的眼子菜组培苗打开瓶盖，放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗2～3天；然后将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，移栽于带有泥土的水箱中。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中在所述步骤(3)中，所述诱导培养基选择添加有0.05～0.1mg/LKT(激动素)和0.05～0.1mg/LNAA(萘乙酸)的MS培养基，其中MS培养基包含有蔗糖质量浓度为3%，琼脂质量浓度为6g/L，调节其pH为5.8～6.0。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中在所述步骤(4)中，所述增殖培养基选择添加有0.5～1mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)和0.05～0.1mg/LNAA(萘乙酸)的MS培养基，其中MS培养基包含有蔗糖质量浓度为3%，琼脂质量浓度为6g/L，调节其pH为5.8～6.0。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中在所述增殖培养基中还添加有无菌水和/或无菌营养液。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中在所述步骤(5)中，所述生根培养基选择添加有0.5～1mg/LIBA(吲哚丁酸)的1/2MS培养基，其中MS培养基包含有蔗糖质量浓度为1.5%，琼脂质量浓度为6g/L，调节其pH为5.8～6.0。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中在所述生根培养基中还添加有无菌水和/或无菌营养液。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中所述无菌水为蒸馏水在121℃温度下灭菌25分钟制备而成，而所述无菌营养液为未添加植物生长素和琼脂的营养液，并在121℃温度下灭菌25分钟制备而成。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其在所述步骤(6)中，在移栽过程中，所述水箱中的水深为2cm，泥土深为10cm。进一步地，本专利技术所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其中所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基均在121℃温度下灭菌25分钟，并在灭菌前调整其pH值为5.6～5.8。采用本专利技术所述方法，培养基中的MS培养基为植物组织培养技术中常用基本培养基配方，具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。KT的中文名为激动素/6-糠基氨基嘌呤，植物细胞分裂素的一种，是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，分子式C10H9N5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)外植体采集与预处理：选取长势健壮的眼子菜休眠芽作为外植体，先采用自来水直接冲洗1小时，并无菌纱布滤干；然后置于无菌操作台上，用浸泡75%乙醇的无菌脱脂棉擦拭1次，并去除多余芽鳞、不定根等附着物，再用无菌手术刀将丛生休眠芽单个从基部切断，将切成单个的休眠芽用无菌水反复冲洗4～5次,待用；/n(2)消毒处理：将步骤(1)中获得的眼子菜休眠芽，置于无菌操作台上先用75%酒精充分浸泡30～40s，再用0.1%升汞充分浸泡10 min，取出后采用无菌水反复冲洗4～5次，在置入装有无菌水的玻璃杯中浸泡，待用；/n(3)不定芽诱导：将步骤(2)获得的无菌眼子菜休眠芽，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m

【技术特征摘要】
1.一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体采集与预处理：选取长势健壮的眼子菜休眠芽作为外植体，先采用自来水直接冲洗1小时，并无菌纱布滤干；然后置于无菌操作台上，用浸泡75%乙醇的无菌脱脂棉擦拭1次，并去除多余芽鳞、不定根等附着物，再用无菌手术刀将丛生休眠芽单个从基部切断，将切成单个的休眠芽用无菌水反复冲洗4～5次,待用；
(2)消毒处理：将步骤(1)中获得的眼子菜休眠芽，置于无菌操作台上先用75%酒精充分浸泡30～40s，再用0.1%升汞充分浸泡10min，取出后采用无菌水反复冲洗4～5次，在置入装有无菌水的玻璃杯中浸泡，待用；
(3)不定芽诱导：将步骤(2)获得的无菌眼子菜休眠芽，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；
(4)增殖培养：将步骤(3)诱导出的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，得到叶片颜色深绿，长势较好的眼子菜植株；
(5)生根培养：将步骤(4)诱导出的眼子菜植株用无菌手术刀切分为单株，每株保留3～4片叶片；选择长势较好的眼子菜单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度60～80μmol/(m2.s)条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；
(6)炼苗和移栽：将步骤(5)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的眼子菜组培苗打开瓶盖，放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗2～3天；然后将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，移栽于带有泥土的水箱中。


2.根据权利要求1所述的一种眼子菜休眠芽的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述诱导培养基选择添加有0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋伦，洪开文，陈懿，郑重，陶金，宋泽，刘晶，许锋，
申请(专利权)人：安顺职业技术学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52