一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法技术

本发明专利技术涉及转基因斑马鱼的培育方法，旨在提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。通过观察胚胎红色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出肠道有特异性荧光的斑马鱼胚胎，以采用人工饲养方法获得杂交子代。通过杂交子代自交获得稳定遗传的肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼，再将其与野生型斑马鱼测交，筛出100％肠道表达红色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。本发明专利技术方法实施过程简单易控，能够获得肠道特异性表达的启动子和红色荧光蛋白在肠道高效表达的斑马鱼品系；所得斑马鱼品系用于斑马鱼肠道功能的研究，可以随时观察在任何时期的肠道红色荧光蛋白表达特征，满足对斑马鱼肠道功能研究的整体性与完整性要求。

【技术实现步骤摘要】
一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法
本专利技术涉及转基因斑马鱼的培育方法，特别是涉及一种获得肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼的培育方法，和一个用于该培育方法的专用启动子。
技术介绍
斑马鱼(DenioRerio)为鲤科短担尼尔属，饲养简易且繁殖能力较强，鱼卵在体外受精并发育，受精卵发育迅速，胚胎时期各器官原基基本形成，生长周期短，可以进行大规模的基因突变与筛选，且斑马鱼胚胎通体透明，可利用光学仪器对体内生理过程进行可视化分析，这些特点使其成为重要的脊椎动物模型之一。迄今为止，斑马鱼仅有少数消化道特异性表达的启动子被发现，其中包括ifabp基因的启动子。斑马鱼ifabp基因编码肠道脂肪酸结合蛋白，在斑马鱼肠道上皮细胞中特异性表达。斑马鱼ifabp基因长度为3295bp，其启动子位于该基因上游192-5000bp，在胚胎发育时期即可发挥作用。GuorMourHer等验证了该基因的启动子可驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎肠道中短暂表达，并获得了稳定肠道表达绿色荧光蛋白GFP及红色荧光蛋白RFP的转基因斑马鱼。DsRed基因编码的蛋白质(以下简称DsRed)由225个氨基酸组成，相对分子质量27.6kDa，激发光554nm，荧光波长586nm。与其他荧光蛋白如GFP和RFP等相比，DsRed的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比，而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。DsRed对pH值不敏感，pH值为4.5～12时仍保持稳定，这使其使用范围更加广泛。但目前尚无可在肠道稳定表达Dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。斑马鱼胚胎发育过程中，肠道发育位置与卵黄十分接近，转基因斑马鱼的肠道特异性荧光极易被卵黄强烈的自发荧光所影响，因而在转基因斑马鱼的培育过程中降低了筛选与育种的效率。构建肠道稳定表达Dsred红色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系，能够使肠道特异性荧光的更易检测与观察，能够在培育过程中，获得较高的筛选效率和荧光蛋白表达效率。因此，培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼由其现实需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQIDNO:1所示；(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQIDNO:2所示；(3)以miniTol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；(5)将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得F1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；(6)将F1代斑马鱼进行自交获得F2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；(7)将F2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的F2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。本专利技术中，所述步骤(1)中，启动子Pifabp的扩增过程包括：(1.1)从成年斑马鱼的肠道组织中获取基因组DNA；(1.2)设计并合成巢式PCR引物，其序列如SEQIDNO:3-SEQIDNO:6所示；(1.3)以步骤(1.1)中提取的斑马鱼基因组为模板，利用步骤(1.2)所述引物进行两轮巢式PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。本专利技术中，所述步骤(2)中，dsred片段的扩增过程包括：(2.1)根据dsred商品化质粒的图谱，设计并合成特异性引物，其序列如SEQIDNO:7-SEQIDNO:8所示；在所述引物上加悬挂序列，用于与ifabp启动子及pTol2质粒融合；(2.2)以dsred商品化质粒为模板，利用步骤(2.1)所述引物进行PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。本专利技术中，所述步骤(3)中，构建重组表达载体的过程包括：(3.1)以纯化的启动子Pifabp和dsred片段为模板进行融合PCR，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化；(3.2)根据miniTol2质粒图谱，设计并合成特异性引物，其序列如SEQIDNO:9-SEQIDNO:10所示；在所述引物上加悬挂序列，用于PCR扩增获得用于克隆的线性化质粒；(3.3)以miniTol2质粒为模板，利用步骤(3.2)所述引物进行PCR扩增，获得用于克隆的线性化质粒，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化；纯化产物用DpnI酶切，去除质粒模板，并将酶切产物纯化回收；(3.4)利用步骤(3.1)所得Pifabp-dsred融合片段和步骤(3.3)所得线性化质粒进行一步克隆，然后将克隆质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态中；(3.5)挑取单菌落进行培养，以Pifabp-dsred融合片段为阳性对照，取菌液进行PCR鉴定；对PCR产物鉴定为阳性克隆的进行测序比对，保存测序完全正确的阳性克隆对应的菌液。本专利技术中，所述步骤(4)中，在斑马鱼受精卵产下后1小时内，将步骤(3)获得的重组表达载体通过显微注射导入斑马鱼单细胞阶段受精卵中；按常规方法饲养，将其定为F0代；本专利技术中，所述步骤(5)中，待F0代发育至性成熟后，将其与WB野生型斑马鱼进行测交；获取3dpf及5dpf的胚胎，观察并筛选肠道中有红色荧光特异性表达的胚胎；按常规方法饲养，并将其定为F1代。本专利技术中，所述步骤(6)中，待F1代发育至性成熟后进行自交；获取3dpf及5dpf的胚胎，观察并筛选出肠道红色荧光特异性表达的胚胎；按常规方法饲养3-4个月至性成熟，与WB野生型斑马鱼进行测交，筛选出后代100％胚胎有荧光信号的定为F2代纯合子，作为纯品系留种保存。本专利技术进一步提供了用于培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的专用质粒，是以miniTol2质粒为骨架，包含肠道特异性表达启动子Pifabp及红色荧光蛋白dsred序列，还含有PolyA序列及Tol2转座酶序列；该质粒的序列如SEQIDNO:11所示。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术方法实施过程简单易控，能够获得肠道特异性表达的启动子和红色荧光蛋白在肠道高效表达的斑马鱼品系；(2)所得斑马鱼品系用于斑马鱼肠道功能的研究，利用红色荧光蛋白在活体鱼中的表达可以随时观察在任何时期的肠道红色荧光蛋白表达特征。使用该方法获得的转基因斑马鱼品系可用于斑马鱼肠道发育机制、食源性病原菌通过消化道感染的致病机制及肠道微生物菌群作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，其特征在于，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：/n(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQ IDNO:1所示；/n(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQ ID NO:2所示；/n(3)以mini Tol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；/n(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；/n(5)将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得F1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；/n(6)将F1代斑马鱼进行自交获得F2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；/n(7)将F2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的F2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，其特征在于，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：
(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQIDNO:1所示；
(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQIDNO:2所示；
(3)以miniTol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；
(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；
(5)将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得F1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；
(6)将F1代斑马鱼进行自交获得F2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；
(7)将F2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的F2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，启动子Pifabp的扩增过程包括：
(1.1)从成年斑马鱼的肠道组织中获取基因组DNA；
(1.2)设计并合成巢式PCR引物，其序列如SEQIDNO:3-SEQIDNO:6所示；
(1.3)以步骤(1.1)中提取的斑马鱼基因组为模板，利用步骤(1.2)所述引物进行两轮巢式PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，dsred片段的扩增过程包括：
(2.1)根据dsred商品化质粒的图谱，设计并合成特异性引物，其序列如SEQIDNO:7-SEQIDNO:8所示；在所述引物上加悬挂序列，用于与ifabp启动子及pTol2质粒融合；
(2.2)以dsred商品化质粒为模板，利用步骤(2.1)所述引物进行PCR扩增，PCR产物经分离鉴定后进行回收纯化。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，构建重组表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：单颖，李肖梁，方维焕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33