本发明专利技术涉及癌症特异性反式剪接核酶及其的用途。根据本发明专利技术的反式剪接核酶不作用于正常组织，而是在癌症组织中特异性表达，从而安全性高，并且在转录后水平上表达效率优异，因此可有效地用于癌症的治疗。具体地，根据本发明专利技术的重组载体由于含有CMV启动子、SD/SA和WPRE序列，从而具有较高的核酶的表达效率，并且由于含有miR‑122T，而可以通过miR‑122调节活性，因此具有优异的安全性。因此，在以HCV为起因的肝癌中，除了miR‑122在癌组织中的表达高于正常组织的部分肝癌之外，根据本发明专利技术的反式剪接核酶可以有效地用于治疗所有肝癌，也可有效地用于治疗实质上不本表达miR‑122的其他癌症。
【技术实现步骤摘要】
癌症特异性反式剪接核酶及其用途
本专利技术涉及癌症特异性反式剪接核酶及其用途。
技术介绍
端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白(ribonucleoprotein)，通过将TTAGGG序列重复添加至位于染色体3'端的端粒末端，以恢复在DNA复制时缩短的端粒部位，从而使得细胞能够永生性增殖。端粒酶是调节癌细胞永生性和增殖能力的最重要的酶之一，造血细胞和80-90％的癌细胞具有端粒酶活性，而癌细胞附近的正常细胞不具有此活性，端粒酶的再激活进一步对晚期转移性癌症的无限生长产生主要影响。人的端粒酶由用作底物RNA的人端粒酶RNA(hTR)和起到催化作用的端粒酶逆转录酶(hTERT)两个部分组成。人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达与端粒酶活性成比例，并且细胞内hTERT水平与细胞的端粒酶活性之间存在很强的相关性。尤其，在超过90％的癌症患者中观察到了TERT活性。近来，在已知靶向上述hTERT的反式剪接核酶的同时，也积极地尝试使用这种酶来开发癌症治疗剂。但是，反式剪接核酶和组织特异性启动子的组合显示出高度的组织特异性，而表达效率却极低，因此在治疗效率方面的存在缺陷。此外，由于端粒酶活性也在如干细胞、造血干细胞、生殖细胞和再生正常肝细胞等的正常细胞中表达，所以靶向hTERT的治疗会引起对这些细胞的毒性。已知，尽管肝细胞较弱，但5％的正常肝细胞仍具有端粒酶活性，且再生肝(regeneratingliver)的端粒酶活性会有增加。尤其，肝细胞癌(HCC)大部分伴随有肝硬化，虽然TERT在肝硬化部位构成再生性结节的非肿瘤性肝细胞(non-tumoroushepatocytes)中的表达水平较低，但仍然会表达TERT。韩国专利第10-2016-0038674号公开了一种重组载体及由该载体表达的核酶在预防或治疗癌症中的用途，所述重组载体在核酶目的基因表达盒中与用于识别微小RNA-122(microRNA-122、miR-122)的核酸序列进一步连接，所述核酶目的基因表达盒包含组织特异性启动子、靶向癌症特异性基因的反式剪接核酶以及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因。所述miR-122是一种已知的在正常肝脏中极为过度表达的微小RNA，并在进展为肝癌时，其表达会下降。基于这种现象，虽然现有技术通过将miR-122靶位点引入至核酶表达载体的3'UTR位点，以使递送至肝脏的核酶不会被过度表达于正常肝脏中的miR-122所表达，但能在miR-122水平下降的肝癌中表达并发挥作用。然而，现有技术的问题在于，为了显示出治疗效果，需要使用高浓度的导入有载体的病毒进行处理。此外，据报道，与正常肝脏相比，在由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝癌组织中，大多情况下miR-122的表达有增加。因此，问题在于能否应用于miR-122的表达有增加的肝癌、或肝癌之外的其他癌症。【现有技术文献】【专利文献】专利文献1：韩国专利公开号10-2016-0038674。
技术实现思路
技术问题为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种具有优异的安全性和表达效果的癌症特异性反式剪接核酶在癌症治疗中的用途。技术方案本专利技术提供一种重组载体，其特征在于，包含(i)巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子；和(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶、及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)的核酸序列连接。此外，本专利技术还提供给一种基因传递系统，其包含所述重组载体。此外，本专利技术还提供给一种核酶，其由所述重组载体表达。此外，本专利技术还提供给一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为有效成分的所述重组载体、基因传递系统、或者核酶。有益效果根据本专利技术的反式剪接核酶不作用于正常组织，而是在癌症组织中特异性表达，从而安全性高，并且在转录后水平上表达效率优异，因此可有效地用于癌症的治疗。具体地，根据本专利技术的重组载体由于含有CMV启动子、SD/SA和WPRE序列，从而具有较高的核酶的表达效率，并且由于含有miR-122T，而可以通过miR-122调节活性，因此具有优异的安全性。因此，在起因为HCV的肝癌中，除了miR-122在癌组织中的表达高于正常组织的部分肝癌之外，根据本专利技术的反式剪接核酶可以有效地用于治疗所有肝癌，也可有效地用于治疗实质上不本表达miR-122的其他癌症。附图说明图1示出了本专利技术的基于CMV启动子的hTERT靶反式剪接核酶和目的基因表达盒的组成的示意图。图2示出了在不表达miR-122的Hep3B细胞株(a)和表达miR-122的Huh-7.5细胞株(b)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。图3示出了在不表达miR-122的细胞株(a：Hep3B、b：SNU398、c：SNU449)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。图4示出了在表达miR-122的细胞株(a:Huh-7、b:Huh-7.5)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。图5示出了在表达或不表达miR-122的各种肝癌细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。图6示出了在源自肝癌患者的对索拉非尼(Sorafenib)具有敏感性、或不具有敏感性的细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。图7示出了在动物肝癌模型中，根据表达ECRT或ECRT-122T的腺病毒的注射剂量，对肿瘤的重量(a)、肿瘤组织(b)和肝酶(GOT：谷氨酸草酰乙酸转氨酶、GPT：谷氨酸丙酮酸转氨酶)的确认结果。图8示出了在表达miR-122的Huh-7细胞株中，根据转导的重组载体的MOI的RNA表达量(a:E4、b:核酶、c:miR-122)的图。图9示出了在表达miR-122的Huh-7.5细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的RNA表达量(a:E4、b:核酶、c:miR-122)的图。图10示出了在具有miR-122四环素可调控系统的Hep3B稳定的细胞株克隆(#7-14、7-4和7-2)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI和四环素浓度的细胞存活率、miR-122表达量和核酶表达量的图。图11示出了肝癌患者的正常肝组织和肝癌组织中的miR-122的表达量的比较图(a：所有患者组、b：HBV相关患者组、c：HCV相关患者组、d：酒精相关患者组、e：HBV和HCV相关的患者除外的慢性乙型肝炎患者组、f：其他病因患者组)。图12示出了源自患者的肝癌细胞的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组载体，其包含:/n(i)巨细胞病毒(CMV)启动子；和/n(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶，及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，/n所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，/n(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(miR-122)的核酸序列连接。/n
【技术特征摘要】
20190222 KR 10-2019-0021191;20200220 KR 10-2020-001.一种重组载体，其包含:
(i)巨细胞病毒(CMV)启动子；和
(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶，及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，
所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，
(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(miR-122)的核酸序列连接。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述癌症特异性基因序列为选自TERT(端粒酶逆转录酶)mRNA、AFP(甲胎蛋白)mRNA、CEA(癌胚抗原)mRNA、PSA(前列腺特异性抗原)mRNA、CKAP2(细胞骨架相关蛋白2)mRNA和突变型RAS(大鼠肉瘤)mRNA的基因序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述TERTmRNA序列包含SEQIDNO：2所示的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述反式剪接核酶包含SEQIDNO：3所示的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因为用于治疗癌症的基因或报告基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述用于治疗癌症的基因为选自药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞增值抑制基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制基因、抗原基因、细胞因子基因和抗血管生成基因的基因。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述药物敏感性基因为HSVtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述HSVtk基因包含SEQIDNO：2所示的核酸序列。
9.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述报告基因为萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰型绿色荧光蛋白(mGFP)、增强型绿色荧光蛋白(...
【专利技术属性】
技术研发人员：李城旭，李昌镐，韩升烈，金智贤，赵恩伊，郑珍淑，朱美河，
申请(专利权)人：尔知诺米斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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