一种靶向CD45的打靶载体及其整合至CD45外显子1位点的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD45的打靶载体及其整合至CD45外显子1位点的方法和应用，本发明专利技术找到了CD45中一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并验证了利用该打靶载体能高效整合外源基因至CD45基因位点，后续得到的靶向插入外源基因的CD45‑DTR BAC，可以用于构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞，从而为构建转基因细胞系以及小鼠建立了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD45的打靶载体及其整合至CD45外显子1位点的方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及靶向打靶载体及靶向整合外源基因至CD45外显子1位点的方法和应用。技术背景通过同源重组将外源基因定点整合至靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，这种技术称为基因打靶技术。利用基因打靶技术将外源基因靶向整合至特定的染色体位点在基因疗法、细胞工程、遗传动物模型、基因功能研究及药物开发等中具有重要应用价值，而所有这些应用一方面依赖于转入基因功能的可靠性和可预测性，另一方面要求转入基因不影响内源基因和或其他调控因子的功能。CD45是一种主要表达于免疫细胞表面的信号分子，所以CD45可以作为一个基因敲入的位点，使外源基因在免疫细胞中特异性表达，在其他细胞中不表达。目前针对CD45的基因敲除技术中，为了保证同源重组的效率需要长片段的同源臂，而直接克隆长片段的同源臂较为困难。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的不足，将需要靶向插入的外源基因利用短同源臂先导入相应的BAC克隆，然后提取BAC进一步作为基因打靶的载体，以提高基因打靶的效率，而且我们把插入位点设置在CD45外显子1位点，并利用IRES启动外源基因表达，最小化外源基因插入对细胞功能的影响。为了实现上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：一种靶向CD45的打靶载体，所述打靶载体包含与CD45基因5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之间的外源基因，真核细胞启动子，原核细胞启动子和筛选标志物。进一步的，上述一种靶向CD45的打靶载体，所述打靶载体靶向整合外源基因至CD45基因位点，所述基因位点范围位于小鼠一号染色体138062859-138175756之间或人一号染色体198638968-198757476之间。进一步的，上述一种靶向CD45的打靶载体，所述打靶载体包含从左到右依次为5’端同源臂、IRES基因、外源基因、真核细胞启动子，原核细胞启动子、筛选标志物和3’端同源臂的这部分序列。进一步的，上述一种靶向CD45的打靶载体，所述外源基因为可替换的，包括但不限于选用DTR基因。进一步的，上述一种靶向CD45的打靶载体，所述5’端同源臂的序列为SEQIDNO.3，所述3’端同源臂的序列为SEQIDNO.13。进一步的，上述一种靶向CD45的打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQIDNO.14所示。进一步的，上述靶向CD45的打靶载体的构建方法，包括如下步骤：(1)以RP23-180D23BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段CD45的5’端同源臂；(2)将目的基因片段CD455HA利用酶切位点KpnI、SalI克隆至带阳性选择标记的载体pL451-targeted-empty，得到中间载体pL451-CD455HA-PEN；(3)以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHBEGFWT质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTR；OverlapPCR得到序列如SEQIDNO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；(4)将目的基因片段IRES-DTR利用酶切位点SalI、EcoRI克隆至中间载体pL451-CD455HA-PEN，得到中间载体pL451-CD455HA-IRES-DTR-PEN；(5)以RP23-180D23BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示的正向引物和序列如SEQIDNO.12所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.13所示的基因片段CD45的3’端同源臂；(6)将目的基因片段CD453HA利用酶切位点BamHI、NotI克隆至中间载体pL451-CD455HA-IRES-DTR-PEN，得到序列如SEQIDNO.14所示的打靶载体PL451-loxPIRES-DTRCD453HA5HA。进一步的，根据上述靶向CD45的打靶载体的构建方法来构建靶向插入外源基因的小鼠CD45-DTRBAC克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)电穿孔法将Red/ET表达质粒pRED/ET转化入CD45-DTRBAC克隆，在有氯霉素和四环素抗性的LB平板上筛选，挑取单菌落扩增，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；(2)打靶载体PL451-loxPIRES-DTRCD453HA5HA利用NotI酶切线性化，电穿孔法将线性化的载体转化入上述表达Red/ET的CD45-DTRBAC克隆，使IRES-DTR-PGK-EM7-Neo靶向插入CD45-DTRBAC；(3)成功插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的DC-SIGNBAC克隆表达新霉素抗性，用有新霉素和氯霉素的LB平板筛选得BAC克隆DCSIGN-IRES-DTR-PEN；(4)挑选单克隆并鉴定。进一步的，上述构建靶向插入外源基因的小鼠CD45-DTRBAC克隆的方法，所述步骤(4)中的鉴定步骤具体为：利用序列如SEQIDNO.15所示的正向引物和序列如SEQIDNO.16所示的反向引物作菌落PCR进行鉴定，成功插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的CD45BAC克隆能够得到约1kb的条带。进一步的，上述构建靶向插入外源基因的小鼠CD45-DTRBAC克隆的方法在构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞系方面的应用。至此，本专利技术提供了靶向打靶载体及靶向整合外源基因至CD45外显子1位点，构建靶向插入外源基因的小鼠CD45-DTRBAC克隆的制备和检测方法。综合上述方案，本专利技术提供了一种靶向CD45的打靶载体及其构建方法和应用，至少有以下方面的有益效果：(1)本专利技术提供了一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并验证了利用该打靶载体能高效整合外源基因至CD45基因位点，后续得到的靶向插入外源基因的CD45-DTRBAC，可以用于构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞，从而为构建转基因细胞系以及小鼠建立了基础。(2)本专利技术克服了同源重组中直接克隆长片段的同源臂较为困难的技术难题，将需要靶向插入的外源基因利用短同源臂先导入相应的BAC克隆，然后提取BAC进一步作为基因打靶的载体，以提高基因打靶的效率；(3)本专利技术提供了一种高效、安全靶向整合外源基因至CD45的方法和应用实例；(4)本专利技术提供了靶向CD45的打靶载体左、右同源臂DNA序列信息及构建方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含与CD45基因 5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之间的外源基因，真核细胞启动子，原核细胞启动子和筛选标志物。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含与CD45基因5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之间的外源基因，真核细胞启动子，原核细胞启动子和筛选标志物。


2.根据权利要求1所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体靶向整合外源基因至CD45基因位点，所述基因位点范围位于小鼠一号染色体138062859-138175756之间或人一号染色体198638968-198757476之间。


3.根据权利要1所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含从左到右依次为5’端同源臂、IRES基因、外源基因、真核细胞启动子，原核细胞启动子、筛选标志物和3’端同源臂的这部分序列。


4.根据权利要3所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述外源基因为可替换的，包括但不限于选用DTR基因。


5.根据权利要求4所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述5’端同源臂的序列为SEQIDNO.3，所述3’端同源臂的序列为SEQIDNO.13。


6.根据权利要求5所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的序列如SEQIDNO.14所示。


7.如权利要求6所述的靶向CD45的打靶载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)以RP23-180D23BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段CD45的5’端同源臂；
(2)将目的基因片段CD455HA利用酶切位点KpnI、SalI克隆至带阳性选择标记的载体pL451-targeted-empty，得到中间载体pL451-CD455HA-PEN；
(3)以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHBEGFWT质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTR；OverlapP...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，
申请(专利权)人：乾元康安苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32