靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用方法，通过将CD45抗体和药物偶联，通过靶向CD45用于高度选择性的清除正常、病变、癌变的免疫细胞，本发明专利技术所述的靶向CD45抗体药物偶联物可用于清除病变或癌变免疫细胞，代替化疗药物，治疗血液系统疾病。本发明专利技术所述的靶向CD45抗体药物偶联物只针对免疫细胞，不会杀伤其他活跃分裂细胞，靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(GVHD)，因此可同时移植大量的赠体成熟免疫细胞，快速建立免疫系统。

【技术实现步骤摘要】
靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及靶向CD45抗体药物偶联物的构建与应用。技术背景血液病包括原发于血液系统的疾病和继发于其他疾病所致血液系统异常的疾病，在医学上血液病也是一种很“庞大”的疾病，它的病种很多，分类很广，主要分为四个大类：造血干细胞疾病、红细胞疾病、粒细胞疾病与出血性疾病,其中前三者可以通过骨髓移植来治疗。骨髓移植分为两类：一类为异基因骨髓移植，一类为自体骨髓移植。异基因与自体骨髓移植各有优缺点。自体骨髓移植的最大缺点为复发率高，原因是自体骨髓中的基因缺陷并未得到修复。异基因骨髓移植需有与患者人类白细胞抗原(HLA)相匹配的父母、子女、同胞以及极少数的无亲缘关系的供髓者所输入的异体骨髓。异基因骨髓移植受到诸多因素及时间影响，其成败的关键之一是HLA(人类白细胞抗原)配型问题，如果骨髓供者与患者(受者)的HLA不同，易发生轻重不等的移植物抗宿主病(GVHD)，甚至危及患者的生命。上述自体和异体骨髓移植方面的缺陷大大影响了血液系统疾病的治愈率。
技术实现思路
抗体偶联药物(antibody-drugconjugate，ADC)是将单克隆抗体药物的高特异性和细胞毒药的高活性相结合，用以提高药物的靶向性、减少毒副作用。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比，ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素，而不依赖抗体对靶点蛋白功能的阻断功能。而CD45是一种主要表达于免疫细胞表面的信号分子，其广泛表达于T细胞、B细胞、粒细胞等免疫细胞，因此CD45靶向免疫细胞的靶点。本专利技术旨在提供一种针对免疫细胞的抗体药物偶联物，通过靶向CD45实现，用于清除正常、病变、癌变的免疫细胞，与自体、异体骨髓移植联用，治疗血液系统疾病、免疫系统疾病，包括但不限于艾滋病。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：靶向CD45的抗体药物偶联物，由靶向部分与药物部分组成；所述靶向部分由单抗或多抗构成，靶向CD45；所述药物部分包括但不限于小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素中的一种或者多种。进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述小分子药物包括Maytansine、Dolastatin、CemadotinTasidotin、Cryptophycin、Eribulinmeslyat、(+)-CC-1065、Adozelesin、Carzelesin、Bizelesin、KW-2189、SJG-136、vedotin、emtansine、ozogamicin、auristatins,taxolderivatives中的一种或者多种；所述大分子毒素包括白喉毒素、假单胞菌外毒素、绿脓杆菌毒素、绿脓杆菌外毒素、菌外毒素中的一种或者多种；所述生物活性肽包括GLP-1；所述细胞裂解免疫活性蛋白包括Fasligands。进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述靶向部分为CD45单抗，所述药物部分为白喉毒素，所述CD45单抗与所述白喉毒素通过包含Furin蛋白剪切酶识别位点序列的氨基酸片段连接。进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物为CD45Ab-DTA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID.3所示。进一步的，包括上述靶向CD45的抗体药物偶联物的药物组合物。进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述生产载体包括编码以下部分氨基酸的核酸序列：靶向CD45抗体轻链、靶向CD45抗体重链、白喉毒素、白喉毒素与重链之间由Furin蛋白剪切酶识别位点的氨基酸以及6XHis。进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述生产载体为pTrioz-CD45Ab-Furin-DTA-6XHis，其序列为SEQIDNO.2。进一步的，上述生产载体为pTrioz-CD45Ab-Furin-DTA-6XHis的构建方法，包括以下步骤:(1)以pTrioz空白质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IgHC；(2)以pIRES-proHBEGFWT质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTA；(3)以步骤2和3得到的基因片段IgHC与DTA为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行OverlapPCR得到序列如SEQIDNO.10所示的融合基因片段IgHC-Furin-DTA-6Xhis；(4)将目的基因片段IgHC-Furin-DTA-6XHis利用酶切位点NheI、AvrII克隆至载体pTrioz，得到载体pTrioz-Furin-DTA-6XHis，如SEQIDNO.1所示；(5)合成如SEQIDNO.11所示序列CD45Ab轻链；以合成产物为模板，利用序列如SEQIDNO.12所示的正向引物和序列如SEQIDNO.13所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.14所示的基因片段CD45AbL；将PCR产物利用酶切位点NcoI、BsiWI克隆至载体ppTrioz-Furin-DTA-6XHis，得到载体pTrioz-L-Furin-DTA-6XHis,如SEQIDNO.15所示。(6)合成如SEQIDNO.16所示序列CD45Ab重链；以合成产物为模板，利用序列如SEQIDNO.17所示的正向引物和序列如SEQIDNO.18所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.19所示的基因片段CD45AbH；将PCR产物利用酶切位点NheI、EcoRV克隆至载体ppTrioz-L-Furin-DTA-6XHis，得到生产载体pTrioz-CD45Ab-Furin-DTA-6XHis,如SEQIDNO.2所示。进一步的，使用上述生产载体生产CD45Ab-DTA重组蛋白的方法，包括以下步骤：(1)培养TR细胞(所述TR细胞的构建见实施例8)；(2)取pTrioz-CD45Ab-Furin-DTA-6XHis生产载体转染至TR细胞；(3)培养转染后的TR细胞并收取CD45AbDTA重组蛋白进一步的，上述CD45AbDTA重组蛋白的纯化方法，包括以下步骤:(1)使用Ni-NTASuperflowResin纯化CD45AbDTA；(2)使用NanoDrop测定CD45AbDTA重组蛋白浓度，并调整至2mg/Ml。进一步的，上述CD45AbDTA重组蛋白清楚免疫细胞的测试方法包括如下步骤:(1)在6周大C57小鼠注射CD45AbDTA200ug，一周三次，持续一周(2)用流式细胞仪检测免疫细胞清除程度进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物在制备用于清除正常、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，由靶向部分与药物部分组成；所述靶向部分由单抗或多抗构成，靶向CD45；所述药物部分包括但不限于小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素中的一种或者多种。/n

【技术特征摘要】
1.靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，由靶向部分与药物部分组成；所述靶向部分由单抗或多抗构成，靶向CD45；所述药物部分包括但不限于小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素中的一种或者多种。


2.根据权利要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述小分子药物包括Maytansine、Dolastatin、CemadotinTasidotin、Cryptophycin、Eribulinmeslyat、(+)-CC-1065、Adozelesin、Carzelesin、Bizelesin、KW-2189、SJG-136、vedotin、emtansine、ozogamicin、auristatins,taxolderivatives中的一种或者多种；所述大分子毒素包括白喉毒素、假单胞菌外毒素、绿脓杆菌毒素、绿脓杆菌外毒素、菌外毒素中的一种或者多种；所述生物活性肽包括GLP-1；所述细胞裂解免疫活性蛋白包括Fasligands。


3.根据权要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述靶向部分为CD45单抗，所述药物部分为白喉毒素，所述CD45单抗与所述白喉毒素通过包含Furin蛋白剪切酶识别位点序列的氨基酸片段连接。


4.根据权利要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物为CD45Ab-DTA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID.3所示。


5.包括如权利要求1-4任一项所述的靶向CD45的抗体药物偶联物的药物组合物。


6.表达如权利要求1-4任一项所述的靶向CD45的抗体药物偶联物的生产载体，其特征在于，所述生产载体包括编码以下部分氨基酸的核酸序列：靶向CD45抗体轻链、靶向CD45抗体重链、白喉毒素、白喉毒素与重链之间由Furin蛋白剪切酶识别位点的氨基酸以及6XHis。


7.表达如权利要求4所述的CD45Ab-DTA重组蛋白的生产载体，其特征在于，所述生产载体为pTrioz-CD45Ab-Furin-DTA-6XHis，其序列为SEQIDNO.2。


8.构建如权利要求7所述的表达CD45Ab-DTA重组蛋白的生产载体的方法，包括以下步骤：
(1)以pTrioz空白质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，
申请(专利权)人：乾元康安苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32