本发明专利技术公开了白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45‑DTR转基因小鼠的构建方法与应用，通过酶切线性化BAC Clone CD45‑DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES‑DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，随后将此BALB/C ES细胞通过囊胚注射法构建插入IRES‑DTR至CD45外显子1位点的CD45‑DTR转基因小鼠。本发明专利技术提供一种新型可诱导的、选择性清除免疫细胞的小鼠模型的构建方法，可以广泛应用于制备人源化小鼠，研究免疫细胞功能等领域。
【技术实现步骤摘要】
白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法与应用
本专利技术涉及动物模型构建领域。更具体地，涉及一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法。技术背景免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，其功能是不能被忽视的。为了研究免疫细胞的功能，一个重要的实验就是在体内清除免疫细胞，所以开发能够特异性清除免疫细胞的动物模型具有重要作用，白喉毒素受体-白喉毒素(DTR-DT)系统是近年来发展起来的一种用于诱导特定细胞群凋亡的系统。白喉毒素(DT)是白喉棒状杆菌产生的一种毒素，包含A和B两个亚基，而白喉毒素受体(DTR)又称人类肝素结合的表皮生长因子样生长因子(hbEGF)。当DT通过B亚基与DTR结合时，整个毒素将通过受体介导的内吞作用内化，毒素的亚单位A随后可抑制蛋白质的翻译，导致细胞凋亡而死亡。目前使用DT来诱导制备免疫细胞清除动物模型方面还存在着传代不稳定，免疫细胞清除效率低，选择性差，正常细胞容易受影响等不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的免疫细胞清除动物模型的不足，提供一种新型可诱导的、选择性清除免疫细胞的小鼠模型的构建方法，CD45是一种特异性表达于免疫细胞表面的信号分子，所以我们选择CD45作为驱动DTR表达的基因构建转基因小鼠，这样在免疫细胞中会表达DTR，而不表达的组织中不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以选择性地诱导免疫细胞凋亡。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：S1.酶切线性化BACCloneCD45-DTR载体(由本公司构建，具体构建过程见实施例)，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/CES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/CES细胞；S2.利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/CES细胞，囊胚注射法构建插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S1具体包括以下步骤：(1)小鼠胚胎成纤维细胞用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养层细胞。BALB/CES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养；(2)电穿孔法将利用PI-SceI酶切线性化的打靶载体BACCloneCD45-DTR转入ES细胞，使BACCloneCD45-DTR整合至基因组中；(3)利用G418阳选，挑选得到插入BACCloneCD45-DTR的BALB/CES细胞克隆；(4)提取ES细胞基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S1中的步骤4具体为：提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQIDNO.17的正向引物和序列为SEQIDNO.18的反向引物进行PCR鉴定，插入BACCloneCD45-DTR的ES细胞阳性克隆可见约4.1kb条带。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S2具体包括以下步骤：(1)插入BACCloneCD45-DTRBALB/CES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；(2)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，PCR鉴定。(3)利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠F0与BALB/c雌鼠交配，得到毛色为白色的小鼠可能为DCSIGN-DTR转基因杂合小鼠。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DCSIGN-DTR转基因杂合小鼠，即为F1代小鼠，鼠尾PCR鉴定方法同步骤2。(4)F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代、培育，同时对所得的子代小鼠进行鼠尾PCR鉴定，鉴定方法同步骤2，得到F2代小鼠。按相同方法对小鼠进行传代。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S2中的步骤2具体为：提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQIDNO.19的正向引物和序列为SEQIDNO.20的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见约1.2kb条带。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法在在研究免疫细胞功能方面的应用。进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法在制备人源化小鼠方面的应用。进一步的，如上述白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法建立清除免疫细胞小鼠模型的方法，包括以下步骤:在第1、第2、第4、第7天分别腹腔注射DT(20ng/g)，特异性清除小鼠免疫细胞,建立清除免疫细胞小鼠模型。进一步的，对上述建立清除免疫细胞小鼠模型的方法的验证方案，所述验证方案包括以下步骤：获取小鼠组织，制备成单细胞悬液，用Fcblocker封闭Fc受体后，利用CD45、F4/80、CD11b流式抗体染色。进一步的，对上述建立清除免疫细胞小鼠模型的方法的验证方案，具体包括：获取小鼠表皮，制备成单细胞悬液，用2％FCS-PBS重悬细胞，经Fcblocker封闭Fc受体后，利用anti-mouse-CD45流式抗体染色，染色完毕洗去多余抗体，单细胞悬液用流式细胞仪上机检测。综合上述技术方案，本专利技术公开了一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法与应用，至少有以下方面的有益效果：(1)本专利技术克服了现有免疫细胞清除动物模型的不足，提供了一种能稳定传代的新型可诱导型的、白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠动物模型的制备、使用和检测方法。(2)本专利技术建立了一种高效、安全靶向整合外源基因至小鼠胚胎干细胞基因组CD45外显子1位点的方法，并证实敲入的外源基因表达正常。(3)本专利技术提供了筛选与鉴定阳性细胞株/克隆的方法和应用实例。(4)本专利技术提供了利用转基因ES细胞生产和培育转基因小鼠的方法和应用实例。(5)本专利技术构建得到的白喉毒素调控清除免疫的CD45-DTR转基因小鼠动物模型，免疫细胞清除效率达80％-90％，能够较好地清除免疫细胞，且在不用白喉毒素诱导时，免疫细胞功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除免疫细胞时无副反应，提供了一种全新的免疫细胞清除的原理和方法，提供了一种全新的免疫细胞可诱导清除的动物模型，可以用于免疫细胞的研究以及形成人源化小鼠。附图说明图1：构建靶向小鼠CD45的打靶质粒流程示意图；...
【技术保护点】
1.一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：/nS1. 酶切线性化BAC Clone CD45-DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞；/nS2. 利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，囊胚注射法构建插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。/n
【技术特征摘要】
1.一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：
S1.酶切线性化BACCloneCD45-DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/CES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/CES细胞；
S2.利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/CES细胞，囊胚注射法构建插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。
2.根据权利要求1所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：
(1)小鼠胚胎成纤维细胞用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养层细胞，BALB/CES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养；
(2)电穿孔法将利用PI-SceI酶切线性化的打靶载体BACCloneCD45-DTR转入ES细胞，使BACCloneCD45-DTR整合至基因组中；
(3)利用G418阳选，挑选得到插入BACCloneCD45-DTR的BALB/CES细胞克隆；
(4)提取ES细胞基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤4具体为：
提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQIDNO.17的正向引物和序列为SEQIDNO.18的反向引物进行PCR鉴定，插入BACCloneCD45-DTR的ES细胞阳性克隆可见约4.1kb条带。
4.根据权利要求1所述的一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：
(1)插入BACCloneCD45-DTRBALB/CES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；
(2)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，PCR鉴定；
(3)利用白色...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，
申请(专利权)人：乾元康安苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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