一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用。该质粒载体包括能够在待插入表达的体液免疫疫苗位点(B抗原表位)肽段基因前部5’‑端的：血红蛋白β亚基基因(HBB)的5’‑非翻译区、免疫球蛋白重链ε(IGHE)蛋白信号肽序列；以及基因后部3’‑端的：HBB基因的3’‑非翻译区、和长度为60的Poly(dA)尾部序列。本发明专利技术构建的体外表达mRNA的质粒载体，可以直接将B抗原表位位点插入到表达目标蛋白基因中，表达的mRNA携带有长度为60的poly(A)尾部序列，可直接高效翻译为能在哺乳动物体内或体外培养细胞中表达分泌到细胞外的B抗原表位。

【技术实现步骤摘要】
一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及分子生物学技术、细胞培养、免疫生物学和图像分析等
具体而言，包括通过酶切、连接等方式将带有T7RNA聚合酶结合位点、翻译表达所需关键元件、细胞外分泌定位所需关键元件替换已有表达质粒中原来的可替换区段，构建为一种可在哺乳动物体内或体外培养细胞中表达mRNA的质粒载体pNeoCura-BVac；随后将特定体液免疫疫苗抗原位点(简称B抗原表位)构建为基因片段，插入此载体中构成示例质粒，将此示例质粒转化入适当的大肠杆菌菌株、培育后提取质粒、在体外进行酶切线性化、转录得到示例mRNA；并检测此示例mRNA浓度和纯度，评估此类载体所表达mRNA的能力。
技术介绍
在疫苗位点筛选及疫苗制药技术中，核酸疫苗特别是mRNA疫苗是其中分子疫苗最新发展的领域。mRNA疫苗具有理化性质统一、方便使用统一方案流程制备和大规模高通量筛选有效疫苗抗原位点的特点，呈现出比传统疫苗(灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗)和其它现代分子疫苗(重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗)开发流程更为方便高效的优势。其中可激活人体B细胞特异免疫应答、产生抗体的体液免疫疫苗抗原位点(简称“B抗原表位”)，可以采用将B抗原表位整合到一个mRNA表达载体、直接进行免疫活性检测和筛选的策略。信使核糖核酸(mRNA)是真核生物基因表达的重要一环，在DNA-(转录)-mRNA、mRNA-(翻译)蛋白的中心法则中处于居中的重要地位。成熟mRNA由5’-帽、5’-非翻译区域(5’-UTR)、蛋白编码序列(CDS)、3’-非翻译区域(3’-UTR)、3’-多聚腺苷核酸(3’-poly(A))尾部组成。其中5’-UTR和3’-UTR对mRNA在体内或培养细胞系内的稳定性起到重要作用，而CDS中特定的信号肽和相关结构域等对mRNA翻译所得的蛋白的亚细胞定位起着决定作用。B抗原表位需要在翻译表达为对应肽段后定位为分泌到细胞外，才能引发体液免疫应答反应。目前在分子生物学领域，缺乏适当的学术用或商用可在哺乳动物细胞外表达分泌型B抗原表位的质粒载体。
技术实现思路
在mRNA分子疫苗靶位点筛选包括B抗原表位筛选中需要适当的体外转录表达载体。目前尚无此类载体得到广泛使用。本专利技术的目的是在已有可得到体内或细胞内稳定性和翻译表达能力的mRNA的表达载体的基础上，改造为能够在转录同时添加保持mRNA稳定性和翻译表达能力、且带有B抗原表位所需细胞外分泌定位序列的质粒载体，并确定其可通过体外转录得到高浓度与高纯度的对应mRNA。具体来说，以pNeoCura-BVac为基础，本专利技术采用将pNeoCura-Exp060载体中原有可替换区段替换为带有B抗原表位表达、定位所需元件的区段来解决。本专利技术使用限制性内切酶XbaI和XhoI将pNeoCura-Exp060载体中长度为30的区段移除，并连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7RNA聚合酶识别片段、来自HBB基因的5’-UTR、IGHE蛋白的信号肽序列、BamHI位点、编码2019-nCoVE蛋白的可移除序列、SacI位点、来自HBB的3’-UTR序列、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-BVac质粒载体。本专利技术的第一方面在于提供一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体，包括B抗原表位表达、定位所需元件的区段和长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸polyA片段。在本专利技术的一些实施方式中，所述B抗原表位表达、定位所需元件的区段包括XbaI位点粘性末端、T7RNA聚合酶识别片段、来自HBB基因的5’-UTR、IGHE蛋白的信号肽序列、BamHI位点、编码2019-nCoVE蛋白的可移除序列、SacI位点、来自HBB的3’-UTR序列、XhoI位点粘性末端。在本专利技术的一些实施方式中，还包括pNeoCura-Exp060载体中除了长度为30的可替换区段及Xhol和Xbal之间序列以外的其它序列。在本专利技术的一些实施方式中，还包括启动子序列。在本专利技术的一些实施方式中，所述启动子序列为T7。：本专利技术的第二方面在于提供第一方面所述的表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体的构建方法，包括以下步骤：S01，使用限制性内切酶XbaI和XhoI将pNeoCura-Exp060载体中长度为30的区段移除；S02，并连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7RNA聚合酶识别片段、来自HBB基因的5’-UTR、IGHE蛋白的信号肽序列、BamHI位点、编码2019-nCoVE蛋白的可移除序列、SacI位点、来自HBB的3’-UTR序列、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-BVac质粒载体。在本专利技术的一些实施方式中，包括以下步骤：S11，酶切pNeoCura-Exp060质粒并回收长片段；S12，合成携带有pNeoCura-BVac载体特定插入片段的序列；S13，连接为pNeoCura-BVac载体。在本专利技术的一些实施方式中，S11中，将pNeoCura-Exp060质粒和XbaI、XhoI内切酶、CutSmartBuffer、水按如下比例混合：pNeoCura-Exp060100ngXbaI0.5μLXhoI0.5μLCutSmartBuffer1μL水补至10μL混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μLTris-HCl缓冲液中。在本专利技术的一些实施方式中，S12中，序列1或从包含序列1的空白载体中回收的序列1，和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4Buffer缓冲液按以下比例混合：pNeoCura-Exp060酶切回收长片段0.5μLBVac片段8μLT4连接酶0.5μLT4Buffer1μL混合物在16℃放置1小时；所述序列1为：5’-TCTAGATAATACGACTCACTATAGGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGACTGGACCTGGATTCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACGCGAGTCCACTCCGGATCCATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGGGTTCCTGATCTTCTGGTCTGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体，包括B抗原表位表达、定位所需元件的区段和长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly A片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体，包括B抗原表位表达、定位所需元件的区段和长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸polyA片段。


2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述B抗原表位表达、定位所需元件的区段包括XbaI位点粘性末端、T7RNA聚合酶识别片段、来自HBB基因的5’-UTR、IGHE蛋白的信号肽序列、BamHI位点、编码2019-nCoVE蛋白的可移除序列、SacI位点、来自HBB的3’-UTR序列、XhoI位点粘性末端。


3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于，所述多聚腺苷脱氧核酸polyA片段的长度为60。


4.根据权利要求1-3任一所述的载体，其特征在于，还包括pNeoCura-Exp060载体中除了长度为30的可替换区段及Xhol和Xbal之间序列以外的其它序列。


5.根据权利要求1-4任一所述的载体，其特征在于，还包括启动子序列。


6.根据权利要求1-5任一所述的载体，其特征在于，所述启动子序列为T7。


7.一种根据权利要求1-6任一所述的表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体的构建方法，包括以下步骤：
S01，使用限制性内切酶XbaI和XhoI将pNeoCura-Exp060载体中长度为30的区段移除；
S02，并连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7RNA聚合酶识别片段、来自HBB基因的5’-UTR、IGHE蛋白的信号肽序列、BamHI位点、编码2019-nCoVE蛋白的可移除序列、SacI位点、来自HBB的3’-UTR序列、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-BVac质粒载体。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11，酶切pNeoCura-Exp060质粒并回收长片段；
S12，合成携带有pNeoCura-BVac载体特定插入片段的序列；
S13，连接为pNeoCura-BVac载体。


9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，S11中，将pNeoCura-Exp060质粒和XbaI、XhoI内切酶、CutSmartBuffer、水按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060100n...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘有东，宋麒，王奕，肖安，万季，刘刚，文颖，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44