生殖发育相关基因UCP及其dsRNA在防治桔小实蝇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了生殖发育相关基因

【技术实现步骤摘要】
生殖发育相关基因UCP及其dsRNA在防治桔小实蝇中的应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种与桔小实蝇生殖发育相关的基因UCP及其dsRNA在防治桔小实蝇中的应用。
技术介绍
桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)，又称东方果实蝇(Orientalfruitfly)，俗称果蛆，属双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，果实蝇属Bactrocera，是我国一种毁灭性果蔬害虫，严重危害柑橘、芒果等在内的250多种水果和蔬菜。该虫主要以幼虫取食危害果实，不转果危害；幼虫潜居危害的特性使其难以从果实外观察觉，常随被害果、包装物、运输工具等远距离传播；传入非疫区后遇到适宜环境条件即可迅速蔓延危害，对当地果蔬产业发展构成严重威胁，故被列为世界性检疫害虫。因此，桔小实蝇的防治依旧是我们需要面对的一个重要问题。近年来，有关桔小实蝇的研究日趋深入，已经从最初的生物学基础、生态学，逐步过渡到分子生物学领域。昆虫繁殖对其物种繁衍至关重要。在种群繁衍和扩增过程中，生殖系统对于维持其种群数量及延续至关重要。两性交配是昆虫种群繁衍的一个重要的环节，在受到一些昆虫的生理因素和外部生态因素的干扰后，生殖适合度会受到影响。雌性昆虫的生殖发育主要包括卵巢发育、生殖行为和繁殖力。由于桔小实蝇成虫羽化后需要经历一段时间的生殖发育才能达到性成熟进而交配产卵，所以从防治害虫的角度出发，鉴定并研究桔小实蝇雌成虫生殖发育相关基因，明确其对卵巢发育与繁殖力的调控能力，有利于开发桔小实蝇绿色可持续治理措施。研究表明，多个基因及多种信号途径参与调控雌虫生殖发育过程。雌性昆虫的生殖受多种激素调控，在果蝇Drosophila、德国小蠊Blattellagermanica、埃及伊蚊Aedesaegypti等模式昆虫中，胰岛素、蜕皮激素信号通路均可通过影响卵巢卵黄形成从而调控昆虫的生殖。对果蝇卵子发生前后的对比研究证明，胰岛素信号通路调控脂质储备并抑制生长转变。果蝇敲除Hr39、Beadex基因以及神经肽相关基因Nep1、Nep2、Nep4，都会导致生殖力和产卵量的显著下降。在埃及伊蚊中，卵母细胞的形成受取食血液触发的通路的调节，该通路负责Vg基因的转录，其中20E信号是主要的调节因子。抑制基质金属蛋白酶Mmps活性会导致家蚕Bombyxmori的卵巢发育迟缓，而Mmp的过表达促进卵巢发育。除了对果蝇等模式物种的生殖发育相关基因的研究以外，近年来，桔小实蝇生殖发育也涌现了较大进展。桔小实蝇BdRab40、csn3、csn5和pts基因的沉默均可抑制卵巢发育，显著降低产卵量。在对桔小实蝇卵黄蛋白受体VgR的研究中，发现VgR在卵巢组织中特异性表达，并且在Vg的运输和吸收中起重要作用，通过RNAi技术沉默VgR可显著抑制卵巢发育。将卵黄蛋白基因(Bdyp1)抑制导致卵巢发育迟缓，产卵量显著下降，雌虫产卵器畸形。综上所述，有关生殖发育的研究主要集中于转录水平的卵黄沉积相关基因或信号通路，因而深入研究桔小实蝇雌成虫生殖发育相关基因，不仅可以为阐明生殖发育的复杂机制提供全面的资料，而且有助于开发高效绿色的害虫防控策略。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种参与调控桔小实蝇生殖发育的新基因UCP，沉默该基因后，桔小实蝇卵巢发育被抑制，产卵量显著降低，基因UCP可以作为桔小实蝇防治的新靶标。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：桔小实蝇生殖发育相关基因UCP，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。桔小实蝇生殖发育相关基因UCP的dsRNA，由序列如SEQIDNO.3所述的核苷酸和与其反向互补的核苷酸组成，通过下述方式获得：以桔小实蝇9日龄雌成虫卵巢RNA(1μg)为模板进行去基因组反转录，得到cDNA；以cDNA为模板，进行普通PCR扩增(引物UCP-T7F：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCTGCTTGGCGTCTGCTTA，UCP-T7R：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTGCTGCTTACATTCACCTT)，并用DNA凝胶回收试剂盒回收目标基因片段，回收产物用于进一步合成dsRNA。也可以通过人工合成的方法获得。桔小实蝇基因UCP作为靶标基因在调节桔小实蝇雌虫的卵巢发育和繁殖力中的应用，通过以下方法验证：1)采用初羽化3d的桔小实蝇雌成虫作为实验用虫，每头试虫腹部注射1μl2000ng的目的基因dsRNA，以注射相同量的dsEgfp为对照，每个处理两个生物学重复，每个处理虫数为180头，共进行三次重复实验；2)对RNAi桔小实蝇的卵巢形态、产卵量进行测定，结果表明，沉默UCP后出现约60％极明显的卵巢发育迟缓现象；处理组单雌日均产卵量1-15d均低于对照组，且第1、3、5、7、9、11天具有显著性差异；处理组(28粒)产卵总量也极显著低于对照组(130粒)。3)分别解剖dsUCP注射后24h雌成虫卵巢、脂肪体的样品，提取总RNA反转录为cDNA，并通过qPCR进行检测。qPCR检测发现沉默UCP后，Vg1、Vg2和VgR的表达量均显著上调，胞吞作用相关基因EndophilinB1显著下调。以上结果说明，沉默UCP后可能通过影响胞吞作用进而调节桔小实蝇雌虫的卵巢发育和繁殖力。因此，UCP基因参与调控雌成虫的卵巢发育和产卵量，在桔小实蝇雌虫生殖发育中发挥重要作用，通过dsRNA沉默UCP后，卵巢发育被抑制，产卵量显著下调，基因UCP可以作为桔小实蝇防治的新靶标，dsRNA通过调节雌虫生殖发育可用于防治桔小实蝇，或用于制备桔小实蝇杀虫剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术是国内外首次公开桔小实蝇生殖发育相关基因UCP序列，目前该类基因可调控桔小实蝇雌虫生殖发育的功能没有相关报道。利用桔小实蝇作为受体的RNAi实验证实，与对照组相比，处理组出现极明显的卵巢发育迟缓现象，产卵量极显著低于对照组。桔小实蝇雌成虫沉默UCP可有效抑制桔小实蝇卵巢发育和产卵量，从而有助于桔小实蝇绿色可持续防控。附图说明图1：注射dsUCP对桔小实蝇卵巢发育和产卵量的影响。A-C：注射dsEgfp的卵巢形态；D-F：注射dsUCP的卵巢形态；比例尺为500μm，7d：羽化后七天，10d：羽化后十天，13d：羽化后十三天；G：卵巢平均直径(μm)；H：单雌分别在交配后15天的产卵量；I：单只桔小实蝇交配后15天产卵总量；*代表在P<0.05水平上有显著性差异，**代表在P<0.01水平上有显著性差异，***代表在P<0.001水平上有显著性差异。图2：雌成虫注射dsUCP24小时后检测其对基因UCP表达量的影响。图3：雌成虫注射dsUCP24小时后检测其对相关基因(Vg1、Vg2、VgR、EndophilinB1)表达量的影响。具体实施方式以下实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.桔小实蝇生殖发育相关基因

【技术特征摘要】
1.桔小实蝇生殖发育相关基因UCP，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述基因UCP编码的氨基酸，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种抑制桔小实蝇雌虫生殖发育的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑薇薇，张芮，张宏宇，李晓杨，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42