反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法技术

本发明专利技术公开了一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达和纯化方法，重组蛋白包括：编码反光素蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件。其表达方法包括：扩增核酸片段、制备重组质粒、转化至农杆菌、扩大培养、注射至植物叶片。纯化方法包括透析、聚集、重溶、切割等。本发明专利技术首次利用反光素蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，反光素蛋白融合蛋白可以在叶片中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小蛋白对植物细胞的毒性，延长植物生产该蛋白的周期，增大产量。纯化可通过控制pH使其分离，方法简单，纯度高，成本低。

【技术实现步骤摘要】
反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。
技术介绍
利用植物生物反应器来大规模生产重组蛋白或多肽已被证实为富有前景的系统，相较于传统微生物和哺乳动物生物反应器，植物生物反应器有着低成本、高产量、风险低、规模化容易等优势，已经有多种有价值的重组治疗蛋白或非药用蛋白在植物中表达并得到商业化应用(Biotechnol.Adv.2012.30:1171-1184，Annu.Rev.Anal.Chem.2016.9:271-94)。为了进一步发展植物反应器，来自植物样品的目标蛋白的下游纯化(估计占治疗蛋白情况中生产成本的80％)，是植物生物反应器大规模工业生产重组蛋白中的关键因素。传统的蛋白纯化方法涉及以融合有亲和标签的融合形式表达目标蛋白，亲和标签包括多聚组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、c-myc、strepII、钙调蛋白结合肽等。已出现若干种简化下游蛋白纯化的新策略。油质蛋白(oleosin)融合使所需蛋白质靶向至可从水溶性部分容易分离的油体。疏水蛋白(hydrophobin-I，HFBI)融合改变融合蛋白的疏水性，有利于通过基于表面活性剂的两相系统的纯化。融合有γ-玉米醇溶蛋白结构域(Zera)使重组蛋白形成紧密、ER-定位的蛋白颗粒(proteinbodies，PBs)。类弹性蛋白(ELP)由重复的五肽(VPGXG)(X是除脯氨酸外的任何氨基酸)组成，具有温度敏感性相变性质。当温度升高至其转变温度(Tt)时，可溶性ELP会聚集成不可溶相，通过离心即可沉淀分离。当添加冷缓冲液时，可使聚集的ELP重溶并回复到可溶相。上述Zera、ELP和hydrophobin-I三种标签都含有疏水区，有利于标签及其融合蛋白通过自组装的方式形成PBs(PlantBiotechnol.J.2017.15:671–673)。头足类动物包括章鱼、墨鱼和鱿鱼能够快速地调节自身皮肤的颜色，从而与环境融为一体进行隐蔽，或者与环境形成鲜明的对比，达到警戒猎食者保护自身不受攻击的效果。头足类动物这种动态的颜色变化主要原因之一是由细胞组织中有序排列的微观结构对光线的物理作用而产生的结构性色彩。负责这种动态的结构性色彩的微观结构是由一种特殊的蛋白质——反光素蛋白(reflectin)组成的。反光素蛋白在头足动物的细胞组织中广泛分布，并且具有多种形态和组装类型，它们的光学性质已经被广泛研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法。由于反光素蛋白具有自组装特性及pH值敏感的相变性质，本专利技术首次利用反光素蛋白作为融合标签，在植物中表达重组蛋白，我们发现反光素蛋白融合蛋白可以在烟草叶中形成蛋白颗粒，使形成的蛋白聚集在一起，从而减小蛋白对植物细胞的毒性，延长植物生产该蛋白的周期，增大产量。纯化时可通过控制pH使其分离出来，方法简单，纯度高，成本低。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用。进一步的，所述反光素蛋白为ReflectinA1，ReflectinA2，ReflectinB或ReflectinC；所述ReflectinA1如SEQIDNo.1所示；所述ReflectinA2如SEQIDNo.2所示；所述ReflectinB如SEQIDNo.3所示；所述ReflectinC如SEQIDNo.4所示。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白，包括：a)编码反光素蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；b)编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；c)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；所述第一核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连；所述第三核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连；所述第一核酸元件、第二核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白，包括：a)编码反光素蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；c)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；所述第一核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连，所述第三核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连，形成了可被酶或者化学试剂特异切割的位点，所述第一核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。上述的重组蛋白，进一步的，所述反光素蛋白为ReflectinA1，ReflectinA2，ReflectinB或ReflectinC；所述ReflectinA1如SEQIDNo.1所示；所述ReflectinA2如SEQIDNo.2所示；所述ReflectinB如SEQIDNo.3所示；所述ReflectinC如SEQIDNo.4所示。上述的重组蛋白，进一步的，所述被酶切割的核苷酸序列中，所述酶包括肠激酶、内肽酶Arg-C、内肽酶Glu-C、内肽酶Lys-C和/或凝血因子Xa；所述被化学方法切割的核苷酸序列中，化学方法包括溴化氰切割。上述的重组蛋白，进一步的，所述第三核酸元件为DsRed、SAM或hNGF。基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的重组蛋白的表达方法，所述表达方法包括以下步骤：S1、扩增第一核酸元件、第二核酸元件和第三核酸元件的核酸片段；S2、将扩增获得的核酸片段连接在一起，转化至载体中获得重组质粒；S3、将所述重组质粒转化至农杆菌中，筛选阳性克隆；S4、将所述阳性克隆扩大培养获得菌液；S5、将所述菌液注射至植物叶片中培养，获得蛋白。上述的表达方法，进一步的，所述S1中，所述第一核酸元件为ReflectinA1、ReflectinA2、ReflectinB或ReflectinC；扩增所述ReflectinA1的引物对包括：SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；扩增所述ReflectinA2的引物对包括：SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；扩增所述ReflectinB的引物对包括：SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；扩增所述ReflectinC的引物对包括：SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；和/或，所述第二核酸元件为内含肽(蛋白质内含子)SspDnaB，扩增所述内含肽SspDnaB的引物对包括：SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；和/或，所述第三核酸元件为DsRed、SAM或hNGF，扩增所述DsRed的引物对包括：SEQIDNo.15和SEQIDNo16；扩增所述SAM的引物对包括：SEQIDNo.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种反光素蛋白在作为融合标签中的应用。


2.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白，包括：
a)编码反光素蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；
b)编码能够被酶或化学方法切割的核苷酸序列的第二核酸元件；
c)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；
所述第一核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连；
所述第三核酸元件的3’端与所述第二核酸元件的5’端相连，且所述第二核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连；
所述第一核酸元件、第二核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。


3.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白，包括：
a)编码反光素蛋白的核苷酸序列的第一核酸元件；
c)编码多肽或蛋白质的靶序列的第三核酸元件；
所述第一核酸元件的3’端与所述第三核酸元件的5’端相连，所述第三核酸元件的3’端与所述第一核酸元件的5’端相连，形成了可被酶或者化学试剂特异切割的位点，所述第一核酸元件、第三核酸元件处于同一个阅读框。


4.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于，所述反光素蛋白为ReflectinA1，ReflectinA2，ReflectinB或ReflectinC；
所述ReflectinA1如SEQIDNo.1所示；
所述ReflectinA2如SEQIDNo.2所示；
所述ReflectinB如SEQIDNo.3所示；
所述ReflectinC如SEQIDNo.4所示。


5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于，
所述被酶切割的核苷酸序列中，所述酶包括肠激酶、内肽酶Arg-C、内肽酶Glu-C、内肽酶Lys-C和/或凝血因子Xa；
所述被化学方法切割的核苷酸序列中，化学方法包括溴化氰切割。


6.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于，所述第三核酸元件为DsRed、SAM或hNGF。


7.一种权利要求2至6中任一项所述的重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：
S1、扩增第一核酸元件、第二核酸元件和第三核酸元件的核酸片段；...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘炜松，谢东玲，刘齐军，陈刚，欧军林，宋俊祎，
申请(专利权)人：长沙馥新合成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43