一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20‑11及其编码基因和应用，属于热激蛋白领域。本发明专利技术提供的松墨天牛热激蛋白HSP20基因全长531bp，编码176个氨基酸。通过荧光定量方法，获得了该基因在热胁迫条件下的表达特性，高温会明显诱导该基因的上调，表明此蛋白在松墨天牛幼虫抵御高温胁迫中发挥重要作用。最后构建原核表达载体，通过体外表达的方法，成功获得了纯化的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20‑11。对Ni

【技术实现步骤摘要】
一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11及其编码基因和应用
本专利技术属于热激蛋白领域，更具体地说，涉及一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11及其编码基因和应用。
技术介绍
松墨天牛(Monochamusalternatus)隶属于鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，不仅是我国南方松林中的重要蛀干害虫，还是世界检疫性有害生物松材线虫的主要传播媒介。松墨天牛与松材线虫的侵染循环破坏松树输导组织，导致松树萎蔫病，对我国乃至世界的森林资源造成巨大威胁。松墨天牛主要广布于我国的亚热带及热带地区，由于全球气候变暖，极端高温频现，该害虫在夏季有时要经历高达将近40℃的高温，具有较强的耐热性。在长期的进化过程中，面对外界环境的高温压力，昆虫逐渐形成了一套由躲避，感觉神经元检测，体温调节，热代谢回应，激素分泌及胁迫响应等构成的复杂精密的适应机制。而热激蛋白(HeatShockProtein，HSP)，又称作热休克蛋白，是生物体胁迫响应的重要组分。除了高温胁迫之外，低温、干旱、缺氧、高盐、杀虫剂等生物或非生物胁迫均会诱导热激蛋白的上调。这类蛋白作为分子伴侣，可调控蛋白质的合成、聚集及降解。在高温胁迫下，能量供应受限，蛋白质的合成受阻，热激蛋白会被优先转录，引导其他蛋白质的正确折叠，帮助生物体度过不良环境。根据分子量的大小，热激蛋白被划分为HSP90，HSP70，HSP60，HSP40，和HSP20等5个家族。热激蛋白20属于ATP-独立型热激蛋白，即可在ATP不存在的条件下独立工作。由于面临热胁迫时昆虫的ATP合成减弱，因此，在热胁迫下HSP20作为昆虫抵御胁迫的生理机制中第一道防线，HSP20以寡二聚体的形式形成疏水结合腔与底物蛋白进行结合，防止在热胁迫条件下未折叠蛋白质的错误折叠，以及已折叠蛋白质的受热变性。因此，HSP20家族在昆虫抵御高温胁迫过程中尤为重要。目前，对昆虫热激蛋白的研究主要集中于HSP70及HSP90家族，而对于应对热胁迫的首要防线HSP20研究较少。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因。本专利技术还要解决的技术问题在于提供一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的应用，可有效保护猪心苹果酸脱氢酶的热聚沉。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。扩增所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的引物。含有所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的载体。作为优选，所述的含有松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的载体为PET-28(+)/MaltHSP20-11。含有所述载体的细胞、组织或微生物。所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11在保护蛋白防止热聚沉中的应用。所述的应用具体方法为：将所述的蛋白与所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11在缓冲液中混溶。所述的应用中，所述的蛋白为苹果酸脱氢酶。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11及其编码基因和应用。所提供的松墨天牛热激蛋白HSP20的cDNA序列全长531bp，编码176个氨基酸。通过荧光定量方法，获得了该基因在热胁迫条件下的表达特性，结果显示，高温会明显诱导该基因的上调，在虫体45℃处理3h时相对表达量达到峰值，表明此蛋白在松墨天牛幼虫抵御高温胁迫中发挥了重要作用。最后构建原核表达载体，通过体外表达的方法，成功获得了纯化的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11。对Ni+树脂柱纯化后的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20进行分子伴侣活性验证，表明该蛋白可有效保护苹果酸脱氢酶防止热聚沉。因此，本申请提供的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11及其编码基因，具有极高的应用价值，也为松墨天牛耐热性研究提供了分子依据。附图说明图1为松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11基因在高温胁迫下的表达模式分析结果图；注：大写字母表示同一处理温度不同处理时间之间的差异性，小写字母表示同一处理时间不同处理温度之间的差异性；图2为原核表达产物的检测结果图；图3为过镍柱纯化的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11电泳结果图；图4为MaltHSP20-11蛋白保护苹果酸脱氢酶(MDH)防止热聚沉试验结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。实施例1：克隆松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11基因1、获取松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11基因序列实验材料取自实验室饲养的松墨天牛，蜕皮后4龄幼虫继续饲养3d后，40℃高温胁迫3h后速冻于液氮中保存在-80℃冰箱作为热处理组，同时取饲养条件为25℃的同日龄幼虫速冻于液氮中保存在-80℃冰箱作为对照组。每3只幼虫混为一个样品，每个样品均具备3次生物学重复。样品制备完成后送至上海美吉生物有限公司进行转录组测序。采用Illumina测序平台完成转录组测序，去除测序接头序列、低质量读段、N(N表示不确定碱基信息)率较高序列及长度过短序列后，运用Trinity软件对测序数据进行组装拼接得到unigene，后将uingene通过Blast进行功能注释。通过DESeq2软件鉴定对照组与热处理组中的差异基因，并通过ORF预测，Blast同源比对得到一条在热处理下上调的MaltHSP20-11基因序列。2、总RNA的提取将3日龄的松墨天牛4龄幼虫，分别置于25，35，40，45，50℃处理1，2，3h，每组处理5个重复。处理后立即置于液氮中速冻，保存于-80℃。(1)将幼虫置于研钵中，用液氮进行研磨成粉状转移至2mL无核酶离心管中，加入1.5mL的TRNzolUniversal试剂，混匀静置5min。(2)4℃，12000rpm离心10min，取上清液，转入2mL无核酶离心管中。(3)加入300μL氯仿，剧烈振荡后，静置3min，4℃，12000rpm离心15min。(4)取800μL上层水相于2mL无核酶离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25min。(5)4℃，12000rpm离心10min，去上清。(6)加入1mL的75％乙醇，洗涤沉淀，5000rpm，离心3min，去除液体。(7)重复(6)。(8)室温晾干，加入10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.扩增权利要求2所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的引物。


4.含有权利要求2所述的松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的载体。


5.根据权利要求4所述的含有松墨天牛热激蛋白MaltHSP20-11的编码基因的载体，其特征在于，所述的载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，陈文霞，许高娟，郝德君，夏小洪，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32