启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种启动子多核苷酸、信号多肽和将其编码的多核苷酸以及其用途。包括启动子多核苷酸和编码信号多肽的多核苷酸的载体和宿主细胞可以有效地表达和/或在细胞外分泌外源蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2017年12月29日提交的韩国专利申请号10-2017-0184819的优先权和权益,其通过引用合并于此用于所有目的,如同在此完全阐述一样。
本专利技术涉及一种启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途。
技术介绍
作为用于重组表达的宿主，诸如细菌、酵母和真菌等的微生物正变得越来越重要。诸如乳杆菌属(Lactobacillus)或链球菌属(Streptococcussp.)的细菌可以用作递送工具。通常被认为安全的GRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)微生物可以施用于人类或动物。为了在乳酸菌中实现高水平的外源产物表达，需要可以从乳酸菌中分离并以高水平表达和分泌外源产物，特别是蛋白质的新型启动子和信号多肽。
技术实现思路
本专利技术一方面提供一种分离的启动子。本专利技术另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括所述启动子。本专利技术另一方面提供一种宿主细胞，其包括所述重组多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种使用所述宿主细胞生产产物的方法。本专利技术另一方面提供一种分离的信号多肽和将其编码的多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括编码所分离的信号多肽的多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种宿主细胞，其包括编码所分离的信号多肽的重组多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种使用宿主细胞生产蛋白质的方法，其中，所述宿主细胞包括编码所分离的信号多肽的重组多核苷酸。附图说明通过与附图结合来考虑,这些或/其他方面将根据具体实施例的以下描述变得显而易见且更容易理解。图1为大肠杆菌和乳酸菌之间的穿梭载体pMT48的结构图。图2为pMT54-PR4-IL10-SP4载体的结构图。图3为在用pMT54-PR4-IL10-SP4载体转化三种乳酸菌后确认细胞外表达水平的结果。图4为在用pMT54-PR4-amylase-SP4载体转化LMT1-21菌株后确认细胞外表达水平的结果。图5为通过测量pMT54-P11-IL10-SP4和pMT54-PR4-IL10-SP4载体中IL-10的mRNA水平来比较启动子强度的结果。图6为通过确认由用pMT54-PR4-IL10-SP4和pMT54-PR4-IL10-USP45转化的LMT1-21分泌的IL-10的量来比较信号肽强度的结果。具体实施方式本专利技术一方面提供一种分离的启动子，其包括与SEQNO.1(以下也称为“PR4启动子”)的核苷酸序列具有至少85％的序列同源性的多核苷酸。本专利技术另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括所述启动子。在本说明书中，“启动子(promoter)”是指RNA聚合酶结合并起始转录的核酸分子，特别是DNA分子上的区域。启动子通常位于由启动子调节的转录序列的上游，即，5′。所述启动子可以为组成型启动子(constitutivepromoter)。所述启动子可以与SEQNO.1的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。所述启动子可以具有SEQNO.1的核苷酸序列。所述重组多核苷酸可以为载体。在本说明书中，“载体(vector)”是指可以繁殖(propagate)与其连接的其他核酸的核酸分子。所述载体不仅包括插入所引入的宿主细胞的基因组中的载体，还包括作为自我复制核酸结构(self-replicatingnucleicacidstructure)的载体。表达载体(expressionvector)是指可以指导与其可操作地连接的核酸的表达的载体。所述载体可以为质粒或病毒来源的载体。所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述表达载体可以包括编码可操作地连接至所述启动子的蛋白质的核苷酸序列。所述表达载体可以包括所述启动子；以及包括编码可操作地连接至所述启动子的产物的核苷酸序列的第一多核苷酸。所述产物包括可以通过表达第一多核苷酸而产生的任何产物。所述产物可以为多肽或核酸。所述多肽可以为细胞因子如IL-10或酶如淀粉酶。所述核酸可以为DNA或RNA。在本说明书中，术语“可操作地连接(operablylinked)”是指可以进行转录或翻译以产生功能性转录或翻译产物的连接。所述载体可以进一步包括选自核糖体结合位点(ribosomalbindingsite，RBS)、克隆位点(cloningsite)、选择标记基因(selectionmarkergene)、转录终止子和翻译起始因子中的至少一个。所述克隆位点可以与所述启动子可操作地连接。所述克隆位点可以为多克隆位点。在所述重组多核苷酸中，编码包括与SEQNO.2(以下也称为“SP4信号多肽”)的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的信号多肽的第二多核苷酸可以在所述启动子与第一多核苷酸之间可操作地连接。此时，所述第一多核苷酸可以编码多肽。在本说明书中，“信号多肽(signalpolypeptide)”是指存在于分泌蛋白质前体的N末端侧但不存在于天然存在的成熟蛋白质的序列。所述信号多肽可以从蛋白质前体切下。通常，当细胞外分泌时，信号多肽被蛋白酶切割。所述蛋白酶通常也称为信号肽酶(signalpeptidase)。所述信号多肽可以与SEQNO.2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。所述信号多肽具有可以使与将其编码的核苷酸序列在框内连接的基因表达产物在细胞外分泌的活性。在本说明书中，蛋白质或多肽分子的“分泌(secretion)”是指将蛋白质或多肽分子转运到细菌细胞外(outside)，其包括：蛋白质或多肽分子以完全游离的形式存在于培养基中；蛋白质或多肽分子中只有一部分存在于细菌细胞外；以及蛋白质或多肽分子存在于细菌细胞的表面层上。所述信号多肽源自副干酪乳杆菌，并可以具有促分泌能力。第二多核苷酸可以具有SEQNO.3的核苷酸序列。本专利技术另一方面提供一种宿主细胞，其包括所述重组多核苷酸。所述宿主细胞可以为细菌细胞。所述细菌细胞可以为革兰氏阳性细菌。所述细菌细胞可以属于乳酸菌或埃希氏菌属。所述乳酸菌可以属于乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、片球菌(Pediococcus)或肠球菌(Enterococcus)属。所述重组多核苷酸可以通过常规核酸导入方法导入所述宿主细胞。核酸导入方法包括电穿孔、转化、转导或转染。本专利技术另一方面提供一种产物或其代谢产物的生产方法，其包括：通过在培养基中培养所述宿主细胞来生产产物；以及从培养物中分离所述产物或其代谢产物。所述产物包括可以通过表达第一多核苷酸而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的启动子，其包括与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的多核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 KR 10-2017-01848191.一种分离的启动子，其包括与SEQIDNO：1的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的多核苷酸。


2.一种重组多核苷酸，其包括根据权利要求1所述的启动子。


3.根据权利要求2所述的重组多核苷酸，其中，所述重组多核苷酸为克隆载体或表达载体。


4.根据权利要求3所述的重组多核苷酸，其中，所述表达载体包括可操作地连接至所述启动子的第一多核苷酸，并且所述第一多核苷酸包括编码产物的核苷酸序列。


5.根据权利要求4的重组多核苷酸，其中，所述产物为多肽。


6.根据权利要求2至5中任一项所述的重组多核苷酸，其中，编码信号多肽的第二多核苷酸可操作地连接在所述启动子与所述第一多核苷酸之间。


7.一种宿主细胞，其包括根据权利要求2至6中任一项所述的重组多核苷酸。


8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞属于乳酸菌或埃希氏菌属。


9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述乳酸菌属于乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、链球菌、明...

【专利技术属性】
技术研发人员：金容仁，宋芝闰，尹智爱，赵胜纪，卢炫辰，
申请(专利权)人：玫帝托克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR