miRNA表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种miRNA表达载体及其应用，所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。通过实验测试证明，相比于已知载体，利用本申请的miRNA表达载体能够使待表达miRNA在宿主细胞的线粒体中定向显著表达，从而有助于调节线粒体中miRNA的表达，实现线粒体功能调控，为靶向线粒体的药物开发提供基础。

【技术实现步骤摘要】
miRNA表达载体及其应用
本专利技术涉及生化分子
，特别是涉及一种miRNA表达载体及其应用。
技术介绍
线粒体是胞浆中的具有双层膜结构的细胞器，是细胞氧化磷酸化合成ATP的场所。线粒体参与真核细胞分化、能量代谢、信号传导、钙离子稳态、活性氧生成、凋亡及衰老等功能的调控。胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤，根据WHO分级可分为I-IV级，其中恶性程度最高的是胶质母细胞瘤(IV级)。化疗、放疗及手术治疗对胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的提高生存率及降低死亡率作用不明显。胶质瘤中的线粒体功能失调包括：结构异常，线粒体膜电位改变，凋亡信号通路被扰乱，mtDNA突变，三羧酸循环相关酶突变等。线粒体融合增加，分裂减少，胶质瘤细胞丝状伪足和树突状伪足中出现线粒体。胶质瘤细胞中线粒体脂肪代谢可促进活性氧异常增加，导致细胞凋亡。研究发现，胶质母细胞瘤患者中具有催化NADP+还原为NADPH功能的酶IDH1突变。研究证实，多种化疗药物(如紫杉醇)可通过靶向线粒体功能抑制胶质瘤。在多种肿瘤中，包括胶质瘤，细胞代谢从氧化磷酸化变成有氧糖酵解，这种代谢重构常伴有线粒体过度极化。胶质瘤细胞中的线粒体过度极化可被小分子口服药二氯乙酸逆转，继而导致肿瘤细胞生长受限。三环类抗抑郁药可促进胶质瘤细胞耗氧量降低、细胞色素C释放，诱导细胞凋亡，但由于其副作用而应用受限。因此，靶向线粒体的药物开发将成为治疗胶质瘤潜在的有效的方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性大小在18nt～24nt的一类非编码RNAs，目前已发现的miRNA有上千种。已证实，miRNA在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用，通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslatedregion，3’UTR)结合调控mRNA的翻译和降解。miRNA因表达失调，在肿瘤的发生发展中的多个阶段发挥重要作用。通过miRNA模拟体或者抑制剂调控miRNA的表达和活性可为抗肿瘤治疗提供新的方法。线粒体中存在多种非编码RNA，包括miRNAs、snoRNA、srpRNA、piRNA及重复序列相关的小RNA，在人类肿瘤中通常发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，并且参与线粒体功能调控。为进一步研究线粒体中miRNA在胶质母细胞瘤中的功能，需要在胶质母细胞瘤线粒体中过表达miRNA，但是现有的商业化载体和文献报道的载体均不能有效实现。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种可在线粒体中高效表达miRNA的miRNA表达载体。一种miRNA表达载体，所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。在其中一个实施例中，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复三次以上得到。在其中一个实施例中，所述待表达miRNA为miR-92b-5p、miR-25-5p或miR-34a-5p，其DNA序列分别如SEQIDNO：1～SEQIDNO：3所示。在其中一个实施例中，所述第一启动子为U6启动子，所述第二启动子为CMV启动子。在其中一个实施例中，所述线粒体定位序列为COX8序列，序列如SEQIDNO：4所示。在其中一个实施例中，所述线粒体定位序列的3’端还具有标签蛋白序列。在其中一个实施例中，所述miRNA表达载体的序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术还提供了一种上述miRNA表达载体在线粒体定向表达miRNA中的应用。本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中含有上述miRNA表达载体，或所述重组细胞的基因组整合有上述miRNA表达载体。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物含有上述miRNA表达载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术通过长期筛选优化构建得到的miRNA表达载体，其从5’端到3’端依次具有第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，而目标序列由待表达miRNA即成熟体miRNA的DNA序列重复多次得到。通过实验测试证明，相比于已知载体，利用本申请的miRNA表达载体能够使待表达miRNA在宿主细胞的线粒体中定向显著表达，从而有助于调节线粒体中miRNA的表达，实现线粒体功能调控，为靶向线粒体的药物开发提供基础。附图说明图1为COX8序列和hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列的PCR扩增产物纯化鉴定电泳图；其中，泳道1为marker，泳道2为hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列，泳道3为COX8序列；图2为AfeI酶切pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO的电泳检测结果图；其中，泳道1为marker，泳道2为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO酶切前，泳道3为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO酶切后；图3为Sanger测序验证COX8是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；图4为Sanger测序验证has-miR-92b-5p成熟体三联体是否成功克隆至pLB载体的测序结果；图5为BamHI和EcoRI双酶切has-miR-92b-5p成熟体三联体PCR产物和pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的电泳检测结果图；其中，A为has-miR-92b-5p成熟体三联体的检测结果，泳道1为marker，泳道2为酶切前，泳道3为酶切后；B为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的检测结果，泳道1为marker，泳道2为酶切前，泳道3为酶切后；图6为Sanger测序验证has-miR-92b-5p成熟体三联体序列是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；图7为Westernblot检测线粒体外膜蛋白VDAC以确定分离线粒体的纯度结果图；图8为qRT-PCR检测U251细胞线粒体中has-miR-92b-5p的表达结果图；其中，1为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，2为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO，3为pHBLV-U6-has-miR-92b-5p-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO；图9为qRT-PCR检测pri-miR-92b-5p组(pri-miRNA)、miR-92b-5p成熟体组(miR-92b-5p)、miR-92b-5p三联体组(miR-92b-5p-3)、miR-92b-5p五联体组(miR-92b-5p-5)的U251细胞线粒体中has-miR-92b-5p的表达结果图；图10为荧光原位杂交检测miR-92b-5p在细胞中的定位及表达的显微照片；图11为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA表达载体，其特征在于，所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种miRNA表达载体，其特征在于，所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。


2.根据权利要求1所述的miRNA表达载体，其特征在于，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复三次以上得到。


3.根据权利要求1所述的miRNA表达载体，其特征在于，所述待表达miRNA为miR-92b-5p、miR-25-5p或miR-34a-5p，其DNA序列分别如SEQIDNO：1～SEQIDNO：3所示。


4.根据权利要求1所述的miRNA表达载体，其特征在于，所述第一启动子为U6启动子，所述第二启动子为CMV启动子。


5.根据权利要求1所述的miRNA表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓萍，罗霭玲，徐令，江华，刘晓丹，杨旭，蔡蔓斯，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心广州市妇幼保健院，广州市儿童医院，广州市妇婴医院，广州市妇幼保健计划生育服务中心，
类型：发明
国别省市：广东;44