一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用，其公开了一种在无背景信号检测基础上建立的新型丁酰胆碱酯酶传感策略，在丁酰胆碱酯酶的作用下，实现荧光信号从无到有的转变，进而检测丁酰胆碱酯酶的浓度水平。所述荧光探针通过将丁酰胆碱酯酶的靶向位点引入非发射骨架生成探针P1，避免了检测探针的固有荧光背景，极大地提高了检测灵敏度。在加入丁酰胆碱酯酶后，可以除去环丙基丁酸，进而自发的原位环化，生成荧光产物PF以作为反映BChE活性的指示剂。本发明专利技术不仅可以大幅提高检测灵敏度，还具有良好的选择性及生物相容性，在临床诊断领域具有很大的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用
本专利技术属于丁酰胆碱酯酶活性检测
，涉及一种用于检测细胞内以及组织切片和生物体内的丁酰胆碱酯酶活性水平的方法策略。更具体地，涉及一种非发射探针及其合成方法和它在检测丁酰胆碱酯酶时自发环化生成荧光团进而作为指示剂的应用。
技术介绍
丁酰胆碱酯酶(BChE)又称假性胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅱ。由于BuChE在肝脏合成后立即释放进入血液，因此可作为评价肝细胞合成功能的灵敏指标，测定血清中的BChE浓度水平一般用作肝功能检测试验。据报道，BChE也与阿尔茨海默症(AD)等复杂的神经退行性疾病密切相关，随着AD的发展，BChE水平显著上升，通过跟踪BChE活性来监测相关疾病的发生具有十分重要的意义。现今，BChE活性的检测方法主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、拉曼光谱、pH电位法、分光光度法、放射化学、羟胺比色法和5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)分析等等。对于前三种方法，很难避免操作复杂，灵敏度低和稳定性差的问题，从而阻碍了它们的进一步应用。然而虽然DTNB测定法以硫代丁酰胆碱为底物，具有较高的灵敏度，但因其受到检测系统的潜在干扰，这可能会导致准确性降低。且在羟胺比色法中，乙酰胆碱用作反应性底物，不利于BChE测定，导致不可避免地降低检测灵敏度。因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的非发射型荧光探针。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针，所述探针的结构式为：所述探针将特定的反应位点环丙基丁酸酯引入非发射骨架上，以产生BChE靶标受体P1，从而排除了探针本身中的固有荧光。同时引入BChE后，可以特异性切除环丙基丁酸，并进行自发环化反应，生成的荧光产物可以指示BChE的活性。本专利技术可以通过荧光检测设备进行可视化鉴别，也可进入活细胞、脑组织切片和生物体对内源性丁酰胆碱酯酶进行测定。本专利技术的另一目的是提供一种检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：(1)在0℃下，以无水二氯甲烷为反应介质，以4-(二乙氨基)-水杨醛和环丙烷甲酰氯为反应物，以三乙胺创造碱性环境，混合物在室温搅拌过夜，随后利用二氯甲烷和去离子水萃取分离，通过减压蒸馏除去溶剂，并将粗产物通过柱色谱法纯化(PE：EA＝10：1)，得到化合物1；(2)以无水乙醇为反应介质，以2-氨基苯硫醇和丙二腈为反应物，加入3-5滴乙酸创造酸性环境，室温下搅拌反应4～6h，萃取分离，经减压旋蒸得到化合物2；(3)以无水乙醇为反应介质，以步骤(1)制备的化合物1和步骤(2)制备的化合物2为反应物，加入哌啶作为催化剂，于60℃～90℃下回流4～8h，经减压旋蒸除去溶剂，并将残余物溶于乙酸乙酯，然后用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤后通过硅胶柱色谱法纯化，使用混合物(CH2Cl2：MeOH＝80：1)作为洗脱溶剂，最终得到所述用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针P1。上述荧光探针P1的合成路线如下：上述公开的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针P1的合成方法不仅操作简单，而且提纯方便快捷，适于市面推广与应用。通过本专利技术合成的荧光探针其是一种非发射探针，避免了固有荧光背景带来的干扰，引入检测物后可以进行自发的原位取代反应，生成绿色的发射荧光团用于检测物的指示，且该荧光探针可用于细胞、脑组织切片和生物体水平上的成像。另外，专利技术人通过核磁共振氢谱、碳谱等手段进行表征，以表明荧光探针P1合成成功，具体参见说明书附图1及附图2。优选的，所述步骤(1)中，4-(二乙氨基)-水杨醛、环丙烷甲酰氯和三乙胺的摩尔比为1：(1.2～1.5)：(1.5～2.5)。优选的，所述步骤(2)中，2-氨基苯硫醇和丙二腈的摩尔比为1：(1.2～2.5)。优选的，所述步骤(3)中，化合物1、化合物2与哌啶的摩尔比为1：(1.2～1.5)：(1.2～2.5)。需要说明的是，针对上述公开的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成反应，专利技术人通过创造性试验得到各种原料配比，其中哌啶和三乙胺的配比尤为重要，且哌啶的含量直接影响到反应进行的程度，关系到反应完全及过量处理的步骤；而三乙胺影响到反应的酸碱调控，关系到反应能否顺利进行。本专利技术还有一个目的，就是提供上述荧光探针P1在检测丁酰胆碱酯酶活性中的具体应用。具体包括所述荧光探针在溶剂体系中选择性识别丁酰胆碱酯酶的应用。其中，本专利技术荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应操作如下所示：向含有探针P1的PBS缓冲溶液中加入丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶特异性催化环丙基甲酸酯水解，产生的O-具有亲核性，O-进攻-CN，进而自发的原位环化，生成荧光产物PF。其中本专利技术荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应后形成化合物荧光团PF的1HNMR图谱如附图3所示。优选的，探针与丁酰胆碱酯酶反应的最适条件是：在37℃下于pH为7.4的PBS缓冲溶液中共同孵育90min。具体反应方程式如下所示：并且，如图5所示，所述荧光探针对于丁酰胆碱酯酶的检测限低至0.092μg/mL(由LOD＝3.3σ/k计算所得)，其检测灵敏度相比于大多数现有技术文献均高。在一些应用场景中，还包括所述荧光探针在以丁酰胆碱酯酶为标志物的检测及筛选丁酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。通过采用上述技术方案，本专利技术的有益效果如下：本专利技术合成的荧光探针用以丁酰胆碱酯酶的特异性识别检测，因其结构上含有丁酰胆碱酯酶的识别位点环丙基丁酸酯，该探针本身是基于非发射骨架构建的，避免了自身的荧光背景干扰，在丁酰胆碱酯酶的存在下，此探针会迅速切割环丙基丁酸酯键进而自身发生环化反应，形成具有绿色荧光的荧光团指示剂，因此可以实现对目标物丁酰胆碱酯酶的荧光开启响应。优选的，所述丁酰胆碱酯酶在HEK293细胞中过度表达，在一些癌细胞中表达较低，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性丁酰胆碱酯酶进行检测。优选的，所述荧光探针可用于脑组织切片和生物体内中丁酰胆碱酯酶活性的检测。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用，其是一种基于零背景设计的非发射探针的合成方法及其检测细胞内、脑组织切片和生物体内源性丁酰胆碱酯酶的应用，具有如下优异特性：本专利技术公开合成的荧光探针基于非发射骨架通过引入丁酰胆碱酯酶的识别基团构成靶标探针，在丁酰胆碱酯酶存在时，探针的识别基团被切割，形成了一种荧光团，具有绿色发射性质，通过绿色荧光的强度进而达到检测丁酰胆碱酯酶水平的目的。并且本专利技术所公开的用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：





2.一种如权利要求1所述的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)在0℃下，以无水二氯甲烷为反应介质，以4-(二乙氨基)-水杨醛和环丙烷甲酰氯为反应物，以三乙胺创造碱性环境，混合物在室温搅拌过夜，随后利用二氯甲烷和去离子水萃取分离，通过减压蒸馏除去溶剂，并将粗产物通过柱色谱法纯化，得到化合物1；
(2)以无水乙醇为反应介质，以2-氨基苯硫醇和丙二腈为反应物，加入3-5滴乙酸创造酸性环境，室温下搅拌反应4～6h，萃取分离，经减压旋蒸得到化合物2；
(3)以无水乙醇为反应介质，以步骤(1)制备的化合物1和步骤(2)制备的化合物2为反应物，加入哌啶作为催化剂，于60℃～90℃下回流4～8h，经减压旋蒸除去溶剂，并将残余物溶于乙酸乙酯，然后用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤后通过硅胶柱色谱法纯化，得到所述用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针P1。

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【专利技术属性】
技术研发人员：丁彩凤，张倩，傅彩霞，滕葆晖，张鹏，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37