一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法，包括如下步骤：步骤一：制备抗体；步骤二：胶体金标记抗体；步骤三：试纸卡组装：采用免疫层析法，制备胶体金免疫层析试纸条；步骤四：胶体金标抗体的验证；步骤五：夹心抗体抗体验证；步骤六：灵敏度优化和步骤七：加速稳定性测试。本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体是一种能够对病毒、细菌、支原体和真菌引起的呼吸道感染进行快速检测和鉴别诊断的试剂盒，为临床和家庭早期诊断、及时用药治疗、防治抗生素滥用提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法
本专利技术属于生物医学
，具体是指一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法。
技术介绍
急性呼吸道感染是最常见的感染性疾病，在全球具有较高的发病率和死亡率。呼吸道病原体具有感染力强、传播快、发病急等特点，在儿童、老人、慢性病、营养不良和免疫力低下等患者中，可引起严重的并发症。抗生素为临床治疗呼吸道感染的一种常用药物，但其对病毒引起的呼吸道感染无效。若发病早期不能给予患者正确的抗生素治疗，则有可能发展为重症肺炎。免疫功能低下、基础疾病和医源性因素可诱发肺部真菌感染，而真菌如人冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等，目前均缺乏治疗用的特效药物，在病毒感染初期对病原学进行及时准确的诊断，有助于医护人员精准掌握患者病情，也是急性呼吸道病毒性传染病防控工作顺利实施的重要保障。由于呼吸道不同病原体感染所致的临床症状相似，影像学的表现缺乏特异性，若在未明确病原体的情况下盲目使用抗生素较易引发二重感染和抗生素耐药的风险，因而及早准确判断疾病感染类型是合理应用抗生素治疗、缩短病程以及改善预后的基础，且为临床诊断治疗、合理用药和流行病监控提供病原学参考依据。但是病原体生长缓慢，培养检测的方法时间长，而现有检测方法对操作人员技术有较高要求，需要借助大型检验仪器，检验成本高，如何能快速、多检、简便且准确的检测呼吸道病原体一直是临床医生较难解决的问题。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种能够对病毒、细菌、支原体和真菌引起的呼吸道感染进行快速检测和鉴别诊断的试剂盒，为临床和家庭早期诊断、及时用药治疗、防治抗生素滥用提供技术支持。为了达到上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法，所述试剂盒通过如下步骤制得：步骤一：制备抗体；步骤二：胶体金标记抗体：1)胶体金和抗体的结合：用K2CO3和氯化氢溶液调节pH至蛋白质沉淀点，将待标记的抗体依次稀释后，分别与胶体金胶体液混匀3～5min后，加入1ml的质量分数为10％的氯化钠溶液迅速混匀，放置5min-2h，在580m波长时测定其光密度，确定抗体稳定胶体金的最小浓度，接着将10％体积的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应5～7min后加入牛血清白蛋白并调整至pH8.5，放置室温继续反应；2)胶体金抗体复合物的分离纯化：采用高速离心法进行纯化，以去除未参与标记的过量的抗体、未完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的聚合物，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，离心后得上清液一和沉淀物一，取出上清液一重复上述离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，二次离心后得上清液二和沉淀物二，摒弃上清液二，用与沉淀物二等体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮，并重复离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，三次离心后得上清液三和沉淀物三，摒弃上清液三，取沉淀物三，用沉淀物三的0.01倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液与沉淀物三重新悬浮，并使用0.45μm滤膜过滤除菌，随后在4℃的环境下保存；3)胶体金标记抗体的鉴定：通过胶体金颗粒的水溶液颜色和在波长510～50m之间最大吸光值的检测，反映胶体金颗粒的形状和大小，将金标免疫原溶液滴入有支持膜的镍网，自燃干燥，电镜下观察胶体金颗粒的大小及均匀度，计算100个颗粒的平均直径，随后使用免疫细胞化学滤纸模型鉴定胶体金标记抗体的特异性和敏感性，最后加入稳定剂，冷冻保存；4)胶体金标记抗体的活性测定：采用斑点酶联免疫吸附测定法，取降钙素原、肺炎支原体或白色念珠菌分点样于硝酸纤维素膜上，自然晾干后放入96孔板中，每孔加摩尔浓度为0.01的磷酸盐缓冲溶液，在37℃的温度下封闭1小时，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每孔加入100μL金标抗体液，在37℃的温度下静置1小时，取出硝酸纤维素膜，观察显色结果。步骤三：试纸卡组装：采用免疫层析法，制备胶体金免疫层析试纸条；步骤四：胶体金标抗体的验证：将降钙素原、肺炎支原体和白色念珠菌作为胶体喷点于检测垫上，将胶体金标记降钙素原抗体、肺炎支原体特异性P1蛋白抗体和白色念珠菌特异的细胞壁甘露聚糖抗体喷点在金标结合垫上，跑样10分钟，确定金标抗体的反应性。步骤五：夹心抗体抗体验证：按照试纸条组装步骤，抗原喷点在检测垫上，并将胶体金标抗体喷点到胶体金结合垫上，将病原微生物抗原的磷酸盐缓冲溶液滴涂到样品垫上，跑样10分钟，根据检测区域现象确定夹心可行性。步骤六：灵敏度优化：优化包被抗原、金标抗体、缓冲溶液浓度和作用时间，确定特异性检测抗原的最高灵敏度。步骤七：加速稳定性测试：通过37°破坏性试验检测试剂作用于胶体金试纸条，检测其表现，同时在4°时留样以备长期检测。进一步地，所述步骤一中分别以降钙素原、肺炎支原体灭活菌体、细胞壁甘露聚糖为抗原与弗氏完全佐剂乳化，连续3次免疫白变种实验室小鼠，间隔2周，选取抗体效价大于1:10000的小鼠进行腹腔冲击免疫，免疫后第3天，取小鼠脾脏；随后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇融合剂作用下进行细胞融合形成杂交瘤；接着将杂交瘤细胞经换液培养3次后，以浓度为1.0×106个/mL的细胞，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，腹腔注射白变种实验室小鼠，每天观察小鼠生长状态，待小鼠腹部肿胀，行动迟缓时腹腔抽取腹水；将小鼠腹水按1:100、1:200、1:300、1：400、1:500、1:600、1:700的7个浓度系列配比稀释，采用酶联免疫吸附剂测定的方法检测抗体效价。进一步地，所述步骤三中先将胶体金标记的抗体复合物分别包被于结合物释放垫，37℃干燥后制成金标垫；然后将鼠抗人降钙素原抗体、鼠抗人P1蛋白抗体、鼠抗人细胞壁甘露聚糖抗体分别包被于检测线处，羊抗鼠IgG包被于质控线处，37℃干燥2小时，用摩尔浓度为0.01的磷酸盐缓冲溶液封闭1小时，磷酸盐缓冲溶液洗3次，每次7分钟，并在37℃环境下干燥2小时，制备成检测垫；最后将胶体金金标试纸条的组装于衬板：自上而下一次黏贴预处理过的吸水板、检测垫、胶体金垫和样品垫，组装成用于可同时检测人的降钙素原、肺炎支原体和白色念珠菌的试纸卡Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，真空干燥状态下保存，备用。进一步地，所述步骤七中加速稳定性测试的检测时间为3～7天。进一步地，所述步骤二中2)胶体金抗体复合物的分离纯化的磷酸盐缓冲溶液中含有质量分数为3％的牛血清白蛋白；所述步骤二中4)胶体金标记抗体的活性测定的磷酸盐缓冲溶液中含有质量分数为3％的牛血清白蛋白。进一步地，所述一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒的鉴定方法为：(1)用无菌咽拭子在被检急性呼吸道感染患者口腔咽喉部捻转数次，以尽量粘取较多的分泌物作为检测标本，采集后的咽拭子标本立即检测，若未及时对标本检测，则需密封后保存于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过如下步骤制得：/n步骤一：制备抗体；/n步骤二：胶体金标记抗体：/n1)胶体金和抗体的结合：/n用K

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过如下步骤制得：
步骤一：制备抗体；
步骤二：胶体金标记抗体：
1)胶体金和抗体的结合：
用K2CO3和氯化氢溶液调节pH至蛋白质沉淀点，将待标记的抗体依次稀释后，分别与胶体金胶体液混匀3～5min后，加入1ml的质量分数为10％的氯化钠溶液迅速混匀，放置5min-2h，在580m波长时测定其光密度，确定抗体稳定胶体金的最小浓度，接着将10％体积的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应5～7min后加入牛血清白蛋白并调整至pH8.5，放置室温继续反应；
2)胶体金抗体复合物的分离纯化：
采用高速离心法进行纯化，以去除未参与标记的过量的抗体、未完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的聚合物，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，离心后得上清液一和沉淀物一，取出上清液一重复上述离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，二次离心后得上清液二和沉淀物二，摒弃上清液二，用与沉淀物二等体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮，并重复离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，三次离心后得上清液三和沉淀物三，摒弃上清液三，取沉淀物三，用沉淀物三的0.01倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液与沉淀物三重新悬浮，并使用0.45μm滤膜过滤除菌，随后在4℃的环境下保存；
3)胶体金标记抗体的鉴定：
通过胶体金颗粒的水溶液颜色和在波长510～50m之间最大吸光值的检测，反映胶体金颗粒的形状和大小，将金标免疫原溶液滴入有支持膜的镍网，自燃干燥，电镜下观察胶体金颗粒的大小及均匀度，计算100个颗粒的平均直径，随后使用免疫细胞化学滤纸模型鉴定胶体金标记抗体的特异性和敏感性，最后加入稳定剂，冷冻保存；
4)胶体金标记抗体的活性测定：
采用斑点酶联免疫吸附测定法，取降钙素原、肺炎支原体或白色念珠菌分点样于硝酸纤维素膜上，自然晾干后放入96孔板中，每孔加摩尔浓度为0.01的磷酸盐缓冲溶液，在37℃的温度下封闭1小时，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每孔加入100μL金标抗体液，在37℃的温度下静置1小时，取出硝酸纤维素膜，观察显色结果。
步骤三：试纸卡组装：采用免疫层析法，制备胶体金免疫层析试纸条；
步骤四：胶体金标抗体的验证：将降钙素原、肺炎支原体和白色念珠菌作为胶体喷点于检测垫上，将胶体金标记降钙素原抗体、肺炎支原体特异性P1蛋白抗体和白色念珠菌特异的细胞壁甘露聚糖抗体喷点在金标结合垫上，跑样10分钟，确定金标抗体的反应性。
步骤五：夹心抗体抗体验证：按照试纸条组装步骤，抗原喷点在检测垫上，并将胶体金标抗体喷点到胶体金结合垫上，将病原微生物抗原的磷酸盐缓冲溶液滴涂到样品垫上，跑样10分钟，根据检测区域现象...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱洪斌，刘蕾，侯霞，吴庆田，李升，
申请(专利权)人：佳木斯大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23