用于LINE-1的检测引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于LINE‑1的检测引物组及其应用，引物组包括如SEQ ID NO.1、2、7和8所述的引物。本发明专利技术一些实例的引物组，具有很好的特异性及极佳的扩增效率。可以用于多种肿瘤的早期筛查、复发诊断、治疗监测，具有简便、快捷、准确的优势。

【技术实现步骤摘要】
用于LINE-1的检测引物组及其应用
本专利技术涉及基因领域，特别涉及用于LINE-1的检测引物组及其应用。
技术介绍
癌症是困扰人类的一大疾病，根据统计数据，2018年全球新增约1810万癌症病例，另有970癌症患者死亡。在中国2018年新发癌症病例约380万，死亡人数约229万，总体癌症发病率上升3.2％左右。癌症已成为我国四大慢性病之一，严重影响人民健康。癌症的早期筛查、诊断能有效的降低癌症死亡率。治疗效果、复发的有效监测能为癌症病人的精准治疗提供可靠参考。目前癌症诊断的金标准是影像学检测。但是影像学检测存在一些局限性：很难在早期发现肿瘤发生，且部分影像学检测存在适应性差〔如肠镜〕、成本较高等缺点。Cell-freeDNA(cfDNA)即游离DNA，是存在于血清、血浆和其它体液(即尿、腹水等)且高度降解的细胞外DNA。主要来源于细胞的凋亡和死亡。当细胞发生癌变时，会释放特异的DNA进入血液，通过检测肿瘤特也cfDNA，可以监测癌症的发生与发展。随着技术的发展循环肿瘤DNA(ctDNA)在肿瘤检测中便捷、快速、无创等优点，表现出很强的优势。然而目前以ctDNA为标志物的检测方法大多需要检测多个基因，且只能监测一种癌症，导致检测成本居高不下，很难广泛推广，且检测特异性和灵敏度较低。长散布元件(LINE-1，longinterspersednucleotidelement1，L1)属于中度重复序列，是人类基因组中最丰富的能自主转座的非末端重复序列反转录转座子，约有850000个拷贝，占基因组的17％。典型的L1元件全长为6500kb，包括5’UTR，两个读码框(ORF1和ORF2)，和3’UTR。两个读码框分别编码两种蛋白，具有分子伴侣活性的非特异RNA结合蛋白(40kDa)及具有反转录酶(RT)和核酸内切酶(EN)的活性150kDa的蛋白质，是反转座作用所必须的。LINE-1过表达可以促进细胞增殖，对肿瘤的预后及转移产生影响。LINE-1反转录转座和甲基化状态在临床诊断、预后、疾病监测以及治疗等方面有着潜在的应用价值。LINE-1与多种肿瘤相关，通过检测LINE-1的表达情况下，可以对多种肿瘤进行筛查。然而LINE-1在人类基因组中虽然存在很多份拷贝，但是由于95％以上的LINE-15′端存在缺失，其中有10％LINE-1还存在重排，因此具有序列全长及转座活性的LINE-1非常少见，具体LINE-1上哪些片段可作为肿瘤筛查的检测靶点，需要对LINE-1相关研究做广泛调研，并需要较为大量样品的验证。且单一引物检测效果可能并不具备足够的特异性和灵敏度，两对甚至多对引物结合可能有更好的效果，如何筛选出合适的引物组合是一个难点所在。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于LINE-1的检测引物组及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种用于游离LINE-1检测的引物组，包括以下至少一对引物：LINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；LINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA。在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。本专利技术的第二个方面，提供：一种用于游离LINE-1检测的试剂盒，其包括本专利技术第一个方面的用于游离LINE-1检测的引物组。在一些实例中，所述试剂盒的引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。在一些实例中，所述试剂盒还包括游离DNA提取试剂。在一些实例中，所述试剂盒为定量PCR试剂盒。本专利技术的第三个方面，提供：本专利技术第一个方面的用于游离LINE-1检测的引物组在制备肿瘤筛查、诊断或监测试剂中的应用。在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：y＝22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2式中，x1为通过引物LINE1-S-ACt值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-ACt值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。肿瘤的情况包括但不限于肿瘤发生的风险、预后、复发风险、治疗进展或响应、转移风险、特别是淋巴转移风险。本专利技术的第四个方面，提供：本专利技术第二个方面的用于游离LINE-1检测的试剂盒在制备肿瘤筛查、诊断或监测试剂中的应用。在一些实例中，所述试剂盒的引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：y＝22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2式中，x1为通过引物LINE1-S-ACt值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-ACt值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。本专利技术的第五个方面，提供：一种用于肿瘤筛查、诊断或监测的系统，包括：游离LINE-1基因提取装置；游离LINE-1基因定量装置，其使用的引物组如本专利技术第一个方面所述；数据处理装置，基于游离LINE-1基因定量的结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：y＝22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2式中，x1为通过引物LINE1-S-ACt值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-ACt值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。实例中负荷指数越高，肿瘤发生风险越高，或进展越严重。在同一肿瘤患者对比中，肿瘤负荷指数升高，说明肿瘤发展出现恶化。本专利技术的有益效果是：本专利技术一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于游离LINE-1检测的引物组，包括以下至少一对引物：/nLINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；/nLINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于游离LINE-1检测的引物组，包括以下至少一对引物：
LINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；
LINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA。


2.一种用于游离LINE-1检测的试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1所述的引物组。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括游离DNA提取试剂。


4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为定量PCR试剂盒。


5.权利要求1所述引物组在制备肿瘤筛查、诊断或监测试剂中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹畅，陈利鹏，赵盼，
申请(专利权)人：邹畅，
类型：发明
国别省市：广东;44