【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
本专利技术总体上涉及制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，以及包含所述表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的组合物和反应混合物。
技术介绍
使用自体T细胞(尤其是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在若干个血液癌症试验中显示出前景。目前，自体基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程，首先要从患者的材料(例如，从白细胞单采术(leukapheresis)中获得的材料)起始，从这种材料中衍生出表达CAR的工程化治疗T细胞。患者白细胞单采材料可以具有高水平的细胞组分变异性。在不同患者之间以及在一种疾病状态下，所述起始材料的细胞组成可以有很大差异。细胞杂质可包括粒细胞、单核细胞、红细胞、循环母细胞和血小板。自体细胞疗法产品的制造过程还必须与患者的不同治疗史、疾病状态等相匹敌，这将进一步影响起始材料的细胞含量(Burger等人,2014，Kaiser等人,2015，Ramos等人,2009)。此外，来自起始材料的此类杂质会对制造过程、最终产品质量和所述产品的治疗功效产生负面影响。因此，需要有更一致地生产表达CAR的细胞疗法产品，从而简化制造过程，改进产品质量，并最大化产品的治疗功效的方法和过程。
技术实现思路
本披露涉及制备表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法，以及包含所述表达CAR的免疫效应细胞的组合物和反应混合物。在一些实施例中，制备方法包括使免疫效应细胞群体与(i)St...
【技术保护点】
1.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：/na)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；/nb)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；/nc)使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触；以及/nd)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，/n由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171025 US 62/577,099;20180302 US 62/637,8541.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括将以下引入所述免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中。
4.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)将以下分子引入所述免疫效应细胞群体中的至少一种细胞中：
gp130分子，例如，通过在允许所述gp130分子翻译的条件下，将编码所述gp130分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；或者
Stat3分子(例如，组成型活性Stat3分子(STAT3C))，例如，通过在允许所述Stat3分子翻译的条件下，将编码所述Stat3分子的核酸引入所述免疫效应细胞群体的至少一种细胞中；以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽、gp130分子或Stat3分子表达的条件下，
由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与Stat3激活剂接触，所述Stat3激活剂选自以下项中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部或者以下项的任何组合：
i)gp130激活剂，例如，与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体，或IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子、OSM分子；
ii)可溶性IL-6受体(sIL-6R)，例如，如本文所述；
iii)IL-6/IL-6R复合物，例如二聚体，例如，如本文所述；
iv)IL-6家族细胞因子(例如，IL-6分子、IL-11分子、IL-27分子、IL-31分子、CNTF分子、CT-1分子、CLC分子、LIF分子、NP分子或OSM分子)；
v)CCL20分子；
vi)IL-10R2受体(IL-10R2)激活剂，例如，IL-10分子、IL-22分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子、IL-29分子，或与IL-10R2结合的抗体分子，例如，如本文所述；
vii)IL-10家族细胞因子(例如，IL-10分子、IL-19分子、IL-20分子、IL-22分子、IL-24分子、IL-26分子、IL-28A分子、IL-28B分子或IL-29分子)；
viii)IL-17家族细胞因子(例如，IL17A分子、IL17B分子、IL17C分子、IL17D分子、IL17E分子或IL17F分子)；或者
ix)IL-23分子。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述gp130分子或Stat3分子的表达是瞬时的(例如，诱导型或非诱导型)或组成型的。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中在使所述免疫效应细胞群体与以下接触之前、同时或之后，将所述gp130分子或所述Stat3分子引入所述免疫效应细胞群体中：
编码CAR多肽的核酸；或者
例如，如本文所述的Stat3激活剂。
8.如权利要求3或4所述的方法，其中包含编码Stat3分子(例如，组成型活性Stat3(STAT3C))的核苷酸的所述核酸进一步包含编码CAR(例如，CD19CAR)的核苷酸序列。
9.如权利要求1-3或5-8中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂是与gp130结合的抗体分子，例如，如本文所述的抗gp130抗体。
10.如权利要求9所述的方法，所述方法产生T细胞例如CD4+或CD8+T细胞的群体，所述群体富集例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中早期记忆T细胞具有以下特征之一或全部：CD27+和/或CD45ROdim/neg。
12.如权利要求10所述的方法，其中未耗尽的早期记忆T细胞具有以下特征中的一个或多个，例如全部：(i)PD-1阴性；(ii)CD27hi；(iii)CCR7hi；或(iv)CD45ROdim/neg。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述T细胞例如早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞的富集群体与未与所述Stat3激活剂接触的T细胞的在其他方面类似的群体相比，例如，具有增加的水平或量的早期记忆T细胞或未耗尽的早期记忆T细胞，例如增加了至少5％，例如多5％-90％(例如至少多5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-50％、50％-70％或70％-90％，例如至少多5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。
14.如权利要求1-3或5-8中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂包括以下一种、两种、三种或全部：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子或CCL20分子。
15.如权利要求1-3或5-9中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂是天然存在的分子、重组分子或纯化分子。
16.如权利要求1-3或5-10中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂不存在于血清中，例如，不以足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3的量存在，例如，如通过实例2的测定所测量的。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂位于例如固定于底物例如珠或细胞上。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述Stat3激活剂位于Stat3激活细胞上。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述Stat3激活细胞是人工抗原呈递细胞。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述Stat3激活剂由所述Stat3激活细胞表达或缀合至所述Stat3激活细胞的表面。
21.如权利要求1-3、5或9-20中任一项所述的方法，其中提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以激活Stat3，例如磷酸化例如酪氨酸705(Y705)上的Stat3，例如，如通过实例2的测定所测量的。
22.如权利要求1-3、5或9-21中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以使所述免疫效应细胞群体在12天的培养期后扩增至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
23.如权利要求1-3、5或9-22中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量以足以使所述免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加，例如，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍。
24.如权利要求1-3、5或9-23中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，提供的例如如本文所述的Stat3激活剂的量足以使所述免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5、10倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的。
25.如权利要求1-3、5或9-24中任一项所述的方法，其中例如，如本文所述的Stat3激活剂为选自以下的一种、两种、三种、四种或全部(例如，五种)：IL-6分子、IL-17分子、IL-22分子、IL31分子和CCL20分子。
26.如权利要求1-3、5或9-25中任一项所述的方法，其中例如，如本文所述的Stat3激活剂包含IL-6分子，例如重组IL-6。
27.如权利要求21所述的方法，其中以至少1、5、10、15、20或30ng/ml或在1-20、1-15或5-15ng/ml的范围内例如至少10ng/ml的量提供所述IL-6分子，例如重组IL-6。
28.如权利要求2、5、或9-13所述的方法，其中所述抗gp130抗体分子选自B-S12或B-P8或者是具有选自B-S12或B-P8的1、2、3、4、5或6个CDR的抗体分子。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法包括使所述免疫效应细胞群体与B-S12和B-P8两者接触。
30.如权利要求28或29中任一项所述的方法，其中抗gp130抗体分子的总量为约0.1-1000、0.5-500或1-100ug/ml。
31.如权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述抗gp130抗体分子以至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2ug/ml，例如约1ug/ml的量提供。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述抗gp130抗体：
诱导gp130介导的信号传导，如通过STAT3的磷酸化所测量的；或者
诱导二聚化，例如，gp130的同源二聚化，或gp130的异源二聚化，例如与LIF、OSM或CNTF。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与在相似条件下培养但未与所述Stat3激活剂接触的细胞的在其他方面相似的群体相比，在例如如本文所述的Stat3激活剂的存在下培养的细胞群体表现出：
Stat3的激活，例如Stat3(例如，在酪氨酸705(Y705)上)的磷酸化，例如，如通过实施例2的测定所测量的；
在12天的培养期后，所述免疫效应细胞群体扩增至少了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍或更多倍，例如，如通过实例2的测定所测量的；
所述免疫效应细胞群体中CD27+PD-1-细胞的百分比增加例如至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5倍或更多倍；和/或
所述免疫效应细胞群体中gp130的表达水平增加至少1.5、2、3、4、5或10倍或更多倍，例如，如通过实施例2的测定所测量的。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括扩增所述群体，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或1-7、7-14或14-21天。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过测量Stat3转录靶例如c-Myc、c-Fos、Sox2、Bcl-2、或RORC的水平或活性来测定所述免疫效应细胞群体中的Stat3途径激活，以确定Stat3途径激活的值。
36.如权利要求35所述的方法，所述方法进一步包括将所述Stat3途径激活值与参考值进行比较，其中所述参考值获得自在类似条件下培养但未与例如如本文所述的Stat3激活剂接触的免疫效应细胞的在其他方面类似的群体。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括响应于所述Stat3途径激活值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低例如如本文所述的Stat3激活剂的浓度。
38.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体的方法，所述方法包括：
a)提供免疫效应细胞群体，例如T细胞群体；
b)使所述免疫效应细胞群体与编码CAR多肽的核酸接触；
c)使所述免疫效应细胞群体与糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)接触，以及
d)将所述细胞维持在允许所述CAR多肽表达的条件下，由此制备表达CAR的免疫效应细胞群体。
39.如权利要求38所述的方法，其中添加一定量的所述糖酵解抑制剂，例如糖酵解小分子抑制剂，例如小分子己糖激酶抑制剂，例如葡萄糖类似物，例如2-DG，所述量足以使得与在类似条件下培养但未用所述糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比：
所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中以至少0.5、1、1.5、2或2.5mM，0.5-2.5mM或1-2mM的浓度添加所述糖酵解抑制剂，例如，2-DG。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中与在类似条件下培养但未用糖酵解抑制剂处理的细胞的在其他方面类似的群体相比，在所述糖酵解抑制剂存在下培养的所述细胞群体表现出：
使所述免疫效应细胞群体增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多；或者
使所述免疫效应细胞群体中具有中枢记忆表型的细胞例如，CD45RO+CCR7+细胞的百分比增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更高。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，所述方法包括：
扩增所述群体，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或1-7、7-14或14-21天；或者
扩增所述群体，例如，细胞数量变化至少1.5、2、2.5、3、4、5、5、7、8、9、10、20、30、40、50倍或更多，例如，最多约40或50倍，例如，在实例1的生长条件下。
43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如，使用2-NBDG摄取测定，例如实施例1的测定，来测定所述免疫效应细胞群体中的葡萄糖代谢，以确定葡萄糖代谢值。
44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述葡萄糖代谢值与参考值比较。
45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括响应于所述葡萄糖代谢值与参考值的比较，进行以下一项或多项：
将所述群体分类为适合或不适合用作治疗剂；
配制或封装所述群体或其等分试样以用于治疗用途；或者
改变培养参数，例如，i)改变培养时长或ii)增加或降低所述糖酵解抑制剂例如所述糖酵解小分子抑制剂，例如所述小分子己糖激酶抑制剂，例如所述葡萄糖类似物，例如2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)的浓度。
46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞群体与如权利要求1所述的Stat3激活剂或如权利要求3或4所述的细胞群体接触。
47.如权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述免疫效应细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·弗拉伊塔，J·J·梅勒霍斯特，E·奥兰多，R·奥康纳，C·H·琼，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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