配体调控的蛋白-蛋白相互作用系统技术方案

公开了一种基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白‑蛋白相互作用系统，其包含：(a)脂质运载蛋白折叠分子，(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，其中脂质运载蛋白折叠分子可结合脂质运载蛋白折叠配体，并且其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子，其结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力的至少10倍，并且其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】配体调控的蛋白-蛋白相互作用系统
本专利技术公开了配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统及其在诊断和治疗中的用途，特别是在肿瘤治疗中的用途。
技术介绍
蛋白-蛋白相互作用(PPI)是在两个或更多个蛋白分子之间建立的高特异性的物理接触，其是由静电力(包括疏水作用)导致的生化事件的结果。许多PPI是在特定生物分子环境中，在细胞或活生物体中发生的链间分子结合的物理接触。在现有技术中，PPI也已用于建立用于制药目的的筛选系统或确定的开关，特别是在人类医学中。PPI的一个具体示例是二聚化，特别是由小分子化学诱导的二聚化(CID)。有几种通过小分子对蛋白进行CID的系统。在这些系统中，PPI(即同源二聚化或异源二聚化)只能在小分子存在下发生，因此起化学二聚作用。在大多数情况下，二聚化蛋白或其各自的结构域被表达为包含目的蛋白的融合构建体的一部分。一些系统不仅在细胞内起作用，而且在细胞外部的氧化环境中也起作用。到目前为止，CID系统主要用于例如调节酶功能、信号转导、基因转录、基因组编辑(例如通过CRISPR/Cas)、蛋白稳定性以及用于生成逻辑门(logicgates)。CID系统也越来越多地被考虑用于临床应用，例如，用于调节用嵌合抗原受体修饰的T细胞的功能。最常使用的系统基于FRB/FBKP结构域用于异源二聚化、或基于突变FKBP结构域用于同源二聚化。已经开发了几种雷帕霉素衍生物，但是它们还没有解决在相同细胞中同时调节两个过程的问题。最新开发的CID系统已经引入了这种功能，该系统基于不同的蛋白以及不同的小分子。这些系统在体外运作良好，但是在体内的使用受到限制。更高的影响将是开发适用于体内甚至临床应用以及同时控制多个过程的CID系统。当前的系统不适合该目的，因为它们基于异种蛋白，因此被认为具有高的免疫原性，和/或由于小分子不适合体内应用。基于FKBP的同源二聚化系统是最先进的系统，并且已经在临床上使用了数年，用于在所施用的T细胞中诱导凋亡。它基于人蛋白、依赖于惰性分子、并且已完全正交化，即二聚体不与内源蛋白结合，而突变的FKBP结构域仅与合成的二聚体结合。这种绝缘蛋白配体对的过程被称为“正交化”，其防止两个方向上不希望的相互作用，并且对于在细胞系统中使用CID系统至关重要。在异源二聚化的情况下，即使是最先进的基于人蛋白的系统(FKBP/FRB系统)仍是不完全正交的。仅针对雷帕霉素类似物(rapalog)与FRB、而不与FBKP相互作用进行蛋白结合口袋的工程化和小分子的互补，其仍然基于野生型FKBP结构域。由于雷帕霉素类似物(rapalogues)与FRB和FKBP的结合模式(关于结构，参见PDB1NSG)，重新设计用于正交化和药代动力学优化的雷帕霉素类似物(rapalogues)具有严重的障碍。此外，雷帕霉素类似物(rapalogues)的合成是困难的，雷帕霉素的潜在污染是危险的，并且该分子未被临床认可。在WO2014/127261A1和WO2017/032777A1中公开了用于CID系统的示例。Voss等人(Curr.Op.Chem.Biol.28(2015)：194-201)公开了化学诱导的二聚化系统，主要是基于雷帕霉素的CID系统，以及使用此类CID其在细胞中可逆地时空控制蛋白功能。然而，结果，据报道，这些当前的CID系统(即使是这些先进的基于雷帕霉素的CID系统)，仍可引起FKBP和FRB不希望的异源二聚化。DeRose等人(Europ.J.Physiol.465(2013)：409-417)综述了CID技术以解决细胞生物学问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供配体调节的PPI系统(LRPPI)，其可以由小分子调节以诱导相互作用配偶体的二聚化，并且与现有的系统相比是有利的。更特别地，新的LRPPI系统可适用于体内，尤其是用于治疗人患者，而没有不良反应的风险或至少具有降低的不良反应。另一个目的是提供用于肿瘤治疗的方法，特别是用于治疗肿瘤的免疫疗法概念。因此，本专利技术提供了基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其包含：(a)脂质运载蛋白折叠分子；(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，其中脂质运载蛋白折叠分子可结合脂质运载蛋白折叠配体，并且其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子，其结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力的至少10倍，并且，其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。本专利技术还涉及基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其包含：(a)脂质运载蛋白折叠分子，(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，其中当脂质运载蛋白折叠配体未结合脂质运载蛋白折叠分子时，脂质运载蛋白折叠分子具有至少第一构象，当脂质运载蛋白折叠配体结合脂质运载蛋白折叠分子时，脂质运载蛋白折叠分子具有至少第二构象；和其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子以第二构象结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力，是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子处于第一构象时亲和力的至少10倍，并且其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。本专利技术基于：在有和没有其他分子(特别是可用作药剂的小分子)的参与下，脂质运载蛋白折叠分子系统结合其结合配偶体(“脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体”)时的高柔性。尽管该系统基于天然存在的对应物，但是本专利技术的系统是人工的。这意味着：通过将本专利技术系统的三个基本成分(脂质运载蛋白折叠分子、脂质运载蛋白折叠配体和脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体)的结合亲和力和特异性调节至所需的结合特异性(特别是对人患者进行靶向和特异性药物干预时所需的特异性)，脂质运载蛋白折叠分子和/或脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体可以衍生自天然存在的支架。脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的天然存在的结合配偶体，该特征对于减少或避免显著的交叉反应性是重要的(该交叉反应性对于本专利技术预期的药学应用的用途是不利的)。这种交叉反应性可能会导致副作用，这种副作用最终变得严重(如果天然存在的脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体是基于脂质运载蛋白折叠分子的“启动开关”系统的一部分，那么这种副作用也可能很难预测)。在本专利技术的过程中，发现基于脂质运载蛋白折叠分子的LRPPI系统具有出人意料的有利特性，这使得它们非常适合用于建立LRPPI系统，该LRPPI系统在人药物治疗中还具有体内作用的能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其包含：/n(a)脂质运载蛋白折叠分子，/n(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和/n(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，/n其中脂质运载蛋白折叠分子可结合脂质运载蛋白折叠配体，并且/n其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子，其结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力的至少10倍，/n其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171220 EP 17208924.5;20180309 EP 18160863.9;20181.一种基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其包含：
(a)脂质运载蛋白折叠分子，
(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和
(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，
其中脂质运载蛋白折叠分子可结合脂质运载蛋白折叠配体，并且
其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子，其结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力的至少10倍，
其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。


2.一种基于脂质运载蛋白折叠分子的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其包含：
(a)脂质运载蛋白折叠分子，
(b)分子量为1500Da或以下的低分子量的脂质运载蛋白折叠配体，和
(c)脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体，
其中当脂质运载蛋白折叠配体未结合脂质运载蛋白折叠分子时，脂质运载蛋白折叠分子具有至少第一构象，当脂质运载蛋白折叠配体结合脂质运载蛋白折叠分子时，脂质运载蛋白折叠分子具有至少第二构象；和
其中结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子以第二构象结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力是未结合脂质运载蛋白折叠配体的脂质运载蛋白折叠分子以第一构象结合脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体的亲和力的至少10倍，
其中脂质运载蛋白折叠结合相互作用配偶体不是天然存在的蛋白，在任何脂质运载蛋白折叠配体的存在下，天然存在的蛋白与任何天然存在的脂质运载蛋白折叠分子的亲和力<10μM。


3.根据权利要求1或2所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中所述脂质运载蛋白折叠分子是与天然存在的iLBP(细胞内脂质结合蛋白)、天然存在的脂质运载蛋白或抗运载蛋白相同的分子，或者是这些分子中任何一个的衍生物，所述衍生物具有1-30个氨基酸交换和/或1-50个氨基酸缺失和/或1-50个氨基酸插入。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中所述脂质运载蛋白折叠分子是天然存在的脂质运载蛋白或iLBP的衍生物，具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25或30个氨基酸交换。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中所述脂质运载蛋白折叠分子是天然存在的脂质运载蛋白或iLBP的衍生物，在结构上保守的β-桶结构以外具有多达15个、多达30个、或多达50个氨基酸缺失和/或多达15个、多达30个或多达50个氨基酸插入，优选结构上对应于选自以下的氨基酸残基的区域：
-根据PDB条目1RBP的氨基酸残基编号方案，人RBP4的氨基酸残基1-20、31-40、48-51、59-70、79-84、89-101、110-113、121-131和139-183，其限定了与人RBP4中结构上保守的β-链相邻的区域；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985的氨基酸残基编号方案，人TLC的氨基酸残基1-13、24-36、44-47、55-61、70-75、80-83、92-95、103-110和118-158，其限定了与人TLC中结构上保守的β-链相邻的区域；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985的氨基酸残基编号方案，人ApoM的氨基酸残基1-43、54-68、76-80、88-95、104-109、114-118、127-130、138-141和149-188，其限定了与人ApoM中结构上保守的β-链相邻的区域；
-根据PDB条目2FS6的氨基酸残基编号方案，人CRABPII的氨基酸残基1-4、13-40、46-49、55-60、66-70、74-80、88-92、97-107、113-118、125-128和136-137，其限定了与人CRABPII中结构上保守的β-链相邻的区域；
-根据PDB条目2F73的氨基酸残基编号方案，人FABP1的氨基酸残基1-4、13-38、44-47、53-58、64-68、72-78、86-90、95-98、104-108、115-118和126-127，其限定了与人FABP1中结构上保守的β-链相邻的区域。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中所述脂质运载蛋白折叠分子是天然存在的脂质运载蛋白或iLBP的衍生物，其在β-桶结构中具有至少70％、优选至少80％、尤其是至少90％的序列同一性，其中该β-桶结构限定为优选结构上对应于选自以下的氨基酸残基区域的区域：
-根据PDB条目1RBP的氨基酸残基编号方案，人RBP4的氨基酸残基21-30、41-47、52-58、71-78、85-88、102-109、114-120和132-138，其限定了人RBP4的结构上保守的β-链；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985所定义，人泪液脂质运载蛋白(TLC)的氨基酸残基14-23、37-43、48-54、62-69、76-79、84-91、96-102和111-117，其限定了人TLC的结构上保守的β-链；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985所定义的人载脂蛋白M(ApoM)的氨基酸残基44-53、69-75、81-87、96-103、110-113、119-126、131-137和142-148，其限定了人ApoM的结构上保守的β-链；
-根据PDB条目2FS6的氨基酸残基编号方案，人细胞视黄酸结合蛋白II(CRABPII)的氨基酸残基5-12、41-45、50-54、61-65、71-73、81-87、93-96、108-112、119-124和129-135，其限定了人CRABPII的结构上保守的β-链；
-根据PDB条目2F73的氨基酸残基编号方案，人脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的氨基酸残基5-12、39-43、48-52、59-63、69-71、79-85、91-94、99-103、109-114和119-125，其限定了人FABP1的结构上保守的β-链。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中所述脂质运载蛋白折叠分子是天然存在的脂质运载蛋白的片段或其衍生物，其长度为至少80个、优选至少100个、尤其是至少120个氨基酸，所述氨基酸至少覆盖脂质运载蛋白折叠中结构上保守的β-桶结构，或者其中所述脂质运载蛋白折叠分子是天然存在的iLBP的片段或其衍生物，其长度为至少80个、优选至少85个、特别是至少90个氨基酸，所述氨基酸至少覆盖脂质运载蛋白折叠中结构上保守的β-桶结构；
其中结构上保守的β-桶结构包含优选结构上对应于选自以下的氨基酸残基区域的氨基酸位置，或由其组成：
-根据PDB条目1RBP的氨基酸残基编号方案，人RBP4的氨基酸残基21-30、41-47、52-58、71-78、85-88、102-109、114-120和132-138，其限定了人RBP4的结构上保守的β-链；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985所定义，人泪液脂质运载蛋白(TLC)的氨基酸残基14-23、37-43、48-54、62-69、76-79、84-91、96-102和111-117，其限定了人TLC的结构上保守的β-链；
-根据Schiefner等人，AccChemRes.2015；48(4)：976-985所定义的人载脂蛋白M(ApoM)的氨基酸残基44-53、69-75、81-87、96-103、110-113、119-126、131-137和142-148，其限定了人ApoM的结构上保守的β-链；
-根据PDB条目2FS6的氨基酸残基编号方案，人细胞视黄酸结合蛋白II(CRABPII)的氨基酸残基5-12、41-45、50-54、61-65、71-73、81-87、93-96、108-112、119-124和129-135，其限定了人CRABPII的结构上保守的β-链；
-根据PDB条目2F73的氨基酸残基编号方案，人脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的氨基酸残基5-12、39-43、48-52、59-63、69-71、79-85、91-94、99-103、109-114和119-125，其限定了人FABP1的结构上保守的β-链。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的配体调节的蛋白-蛋白相互作用系统，其中与脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·特拉克斯迈尔，C·宾格，C·布雷，M·莱纳，
申请(专利权)人：圣安娜儿童癌症研究中心，维也纳农业大学，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT