食道组织和/或类器官组合物及其制备方法技术

本公开涉及通过定向分化将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞转化为特定组织或器官的方法。特别地，本公开涉及从分化的定形内胚层形成的食道组织和/或类器官的形成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】食道组织和/或类器官组合物及其制备方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年10月10日提交的JamesWells的美国临时申请62/570,182的优先权和权益，其内容以其整体出于所有目的并入。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在美国政府支持NIH资助号P01HD093363下完成。美国政府享有本专利技术的某些权利。
技术介绍
食道活跃地促进食物从口腔和咽通过到胃。它由复层鳞状上皮，肌肉层和感知伸张并控制蠕动的肠神经系统组成。先天性疾病(例如食道闭锁)是由导致管腔变窄或不连续的基因突变引起。其他疾病在以后的生活中影响食道，例如食道癌，嗜酸性食道炎，失弛缓症和其他运动障碍。气管和食道疾病在人类中普遍，且难以在小鼠中准确建模。尽管上述疾病状态普遍，且因为小鼠和人类食道之间存在组织结构的实质性差异，所以本领域需要用于研究的人类食道组织模型。本公开解决了本领域中的前述需要中的一个或多个。
技术实现思路
本公开涉及通过定向分化将哺乳动物定形内胚层(DE)细胞转化为特定组织或器官的方法。特别地，本公开涉及从分化的定形内胚层形成的食道组织和/或类器官的形成。附图说明本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明性目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。图1A-1K。通过在前肠球体发育过程中调节Wnt和视黄酸信号传导来规定前段前肠命运。(1A)通过操纵Wnt激活的持续时间(chiron-chr)沿前后轴使前肠球体模式化的实验方案。(1B-1C)不同chiron处理持续时间对前肠球体的模式化的qPCR分析，如通过(1B)前肠标志物SOX2和中/后肠标志物CDX2，和(1C)前段前肠(“AFG”)标志物HNF1B，和后段前肠标志物PROX1和HNF6测量的。(D-E)用1天(1D)和3天(1E)的chiron处理的新生球体(第6天)的HNF1B，SOX2和CTNNB1的整装免疫荧光(“IF”)分析。(1F)使用视黄酸(RA)沿前后轴模式化前肠球体的实验方案。(1G)如通过SOX2，TP63(ΔN亚型)，GATA4和PDX1测量的，改变RA处理的持续时间对3日龄前肠球体的影响。(1J-1K)对未经处理的球体(1I)和用RA处理1天(1J)或4天(1K)的球体中的早期食道标志物SOX2和p63的IF分析。1l-1、1J-1和1K-1显示单独的p63染色。(1H)每个球体中SOX2+和p63+上皮细胞的百分比的定量。比例尺＝25μm。详细信息参见定量和统计分析部分。还参见图8和图9A-R。图2A-2I。前段前肠球体具有食道呼吸能力。(2A)示意图，描绘了沿着背腹轴将AFG球体模式化的实验方案。(2B)指导小鼠和青蛙胚胎的AFG的背腹模式的提示的当前简化模型。(2C-2G)使用背侧标志物SOX2和MNX1(2C+2E)，呼吸标志物NKX2-1(2D)，TP63的ΔN剪接变体(2F)，和复层鳞状上皮标志物KRT4(2G)，用Noggin处理3天的、未经处理的(-ctrl)，或chiron和BMP4(10ng/mL)的3日龄球体(第9天)的qPCR分析。(2H-2I)在Noggin(2H)相比于chiron+BMP4(2I)处理的球体中的SOX2，NKX2-1，CDH1和核(DAPI)的IF染色。比例尺＝25μm。详细信息参见定量和统计分析部分。还参见图10A-10J。图3A-3Y。背侧前段前肠球体形成类器官，其包含表达食道标志物的复层鳞状上皮。(3A)示意图，描述了DE向人食道类器官(HEO)分化。(3B-3F)明场图像，描绘了新生球体向HEO的生长。(G-R)通过转录因子Sox2和p63(3G-3I)，上皮标志物Krt8相比于Krt14(3J-3O)，和上基底(suprabasal)标志物Krt13(3P-3R)的IF分析，E17.5食道(G，J，M，K)与1月龄和2月龄的HEO(3H-3I，3K-3L，3N-3O，3Q-3R)的比较。(3S-3V)通过复层鳞状上皮标志物p63，KRT5，KRT13，IVL，CRNN，1月龄和2月龄的食道类器官的身份和成熟与人胃和肠类器官(HGO和HIO)和小儿食道活检相比的qPCR分析。(3W)2月龄的HEO与胃肠道的各种活检相比的无监督层次聚类(unsupervisedhierarchicalclustering)。(3X)1月龄的HIO，HGO和HEO的主成分分析。(3Y)在重复中取平均值的选定基因(食道，胃，肠)的log2转换标准化TPM值的热图。SSE＝复层鳞状上皮；b＝基底；sb＝上基底；比例尺＝500μm(3B-3F)，50μm(3G-3L)，100μm(3O-3R)，和25μm(3O-1-3R-1)。详细信息参见定量和统计分析部分。还参见图11A-11CC。图4A-4BB。HEO含有祖细胞，其产生分化的复层鳞状上皮。(4A-4B)H&E染色，比较了7周龄HEO与使用从角质形成细胞衍生的HEO生成的器官型筏(raft)。(4C-4N)通过转录因子SOX2和p63(4C-4D)，基底标志物KRT14(4E-4F)，上基底角蛋白KRT4(4G-4H)和KRT13(4I-4J)和分化标志物IVL，CRNN，和FLG(4K-4N)的IF分析，比较7周龄HEO与器官型筏。(4O-4U)食道活检，7周龄HEO，角质形成细胞衍生的HEO，和器官型筏对于SOX2和TP63(4O)，KRT5(4P)，KRT14(4Q)，KRT4和KRT13(4R)，IVL(4S)，CRNN(4T)和食道特异性标志物TMPRSS11A/D(4U)的qPCR分析。(4V)HEO中EdU脉冲追踪标记实验的方案。(4W-4Z)在标记后的各种各样时间点的HEO的IF图像。(4AA-4BB)使用P63强度相比于EdU强度的2D直方图(4AA)和总EdU标记细胞的百分比相比于离上皮基底的距离的1D直方图(4BB)，对IF图像的分析。b＝基部；sb＝上基底。比例尺＝50μm(C-N)，100μm(4A-4B，4S-4V)。详细信息参见定量和统计分析部分。还参见图12A-12R。图5A-5L。Sox2的早期内胚层缺失导致小鼠食道发育不全。(5A-5d)来自以6.5dpc的他莫昔芬强饲的怀孕母畜的对照胚胎(Sox2fl/fl)和Sox2条件性内胚层敲除胚胎(Sox2-DE-LOF，FoxA2CreER；Sox2fl/fl)中的Sox2和Nkx2-1的IF分析。在E9.5(5A-5B)的胚胎切片和在E11.5(5C-5D)的整装IF，其中遮盖图像，突出内胚层。(5E-5F)对于Nkx2-1(5E)和p63(5F)，具有在整装图像(5C-5D)中指示的相对截面的截面的IF图像。插图仅显示Sox2通道(左)和绿色/右(Nkx2-1或p63)通道。(5G-51H)通过来自以8.5dpc强饲的怀孕母畜的E10.5Sox2cKO(Sox2CreER/fl)胚胎中的切割Caspase3染色，对细胞死亡的分析。方框区域被放大并示于(5G-1-5H-1)，内胚层以白色描画轮廓和仅显示切割的Caspase3。(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备食道类器官(EO)的方法，其包括：/na.使定形内胚层与BMP抑制剂、Wnt激活剂、FGF激活剂和视黄酸(RA)接触第一时间段以形成前段前肠培养物，其中所述前段前肠培养物表达SOX2和HNF1B，其中所述前段前肠培养物基本上不表达PROX1和HNF6；/nb.使所述前段前肠培养物与BMP抑制剂(Noggin)和EGF激活剂接触足以形成背侧前段前肠(“dAFG”)球体的第二时间段，其中所述dAFG表达SOX2和TP63但不表达PDX1、PAX9或NKX2.1；/nc.培养所述dAFG足以允许形成食道类器官(EO)的第三时间段，其中所述培养在EGF存在下进行，进一步任选地包括FGF信号传导通路激活剂，优选FGF10。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171010 US 62/570,1821.一种制备食道类器官(EO)的方法，其包括：
a.使定形内胚层与BMP抑制剂、Wnt激活剂、FGF激活剂和视黄酸(RA)接触第一时间段以形成前段前肠培养物，其中所述前段前肠培养物表达SOX2和HNF1B，其中所述前段前肠培养物基本上不表达PROX1和HNF6；
b.使所述前段前肠培养物与BMP抑制剂(Noggin)和EGF激活剂接触足以形成背侧前段前肠(“dAFG”)球体的第二时间段，其中所述dAFG表达SOX2和TP63但不表达PDX1、PAX9或NKX2.1；
c.培养所述dAFG足以允许形成食道类器官(EO)的第三时间段，其中所述培养在EGF存在下进行，进一步任选地包括FGF信号传导通路激活剂，优选FGF10。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP信号传导通路抑制剂选自Noggin、Dorsomorphin、LDN189DMH-1及其组合，优选地其中所述BMP信号传导通路抑制剂为Noggin。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述BMP抑制剂以约50至约1500ng/ml的浓度存在。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WNT激活剂选自一种或多种分子，所述分子选自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、GSKβ抑制剂(例如CHIR99021、即“CHIRON”)、BIO、LY2090314、SB-216763、锂、豪猪抑制剂IWP、LGK974、C59、SFRP抑制剂WAY-316606、β-catenin激活剂DCA。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路激活剂的浓度为约50至约1500ng/ml的浓度。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGF激活剂选自一种或多种分子，所述分子选自：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23，及其组合，优选FGF4或FGF10，或其组合。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FGF通路激活剂的浓度为约50至约1500ng/ml的浓度。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间段是约三天±24小时。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二时间段是三天±24小时


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三时间段是约28天±48小时，或约21天至约90天，或约30天至约60天。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层衍生自前体细胞，所述前体细胞选自胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后内胚层细胞、后内胚层细胞和后肠细胞，优选衍生自多能干细胞的定形内胚层，更优选衍生自选自胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞的多能干细胞的定形内胚层。


12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层是通过使多能干细胞与选自活化素、生长因子的TGF-β超家族的BMP亚组；Nodal、ActivinA、ActivinB、BMP4、Wnt3a及其组合的一种或多种分子接触而衍生。根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DE是DE单层，其中所述DE单层中大于90％的细胞共表达FOXA2和SOX17。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自Noggin、Dorsomorphin、LDN189...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·威尔斯，S·特里斯诺，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，
类型：发明
国别省市：美国;US