基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用制造技术

本发明专利技术公开一种基因IL‑32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：(1)、实验动物及其分组；(2)、实验小鼠取样；(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原变化；(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α‑SMA和Collagen‑α1(I)的表达；(5)、Western Blot检测肝脏α‑SMA的表达；本发明专利技术还公开基因IL‑32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展进程药物方面的应用；本发明专利技术另外还公开基因IL‑32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。本发明专利技术通过小鼠模型实验，验证了IL‑32能够监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程的作用，并为IL‑32在监测血吸虫病肝纤维化发展过程的药物应用提供了理论基础。

【技术实现步骤摘要】
基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用、基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的药物中的应用、基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。
技术介绍
日本血吸虫病是严重危害我国人民身体健康的寄生虫病之一。血吸虫感染后，肝脏虫卵肉芽肿的形成和纤维化引起患者出现门脉高压综合征，并发上消化道大出血、肝昏迷，最终可导致死亡。肝纤维化是肝内纤维合成与降解失衡的复杂动态过程，是胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度累积的结果(SafadiandFriedman2002,BatallerandBrenner2005)。肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)活化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)是肝纤维化发生、发展的中心环节(BatallerandBrenner2005)。HSCs是肝纤维化中ECM的主要来源细胞，当各种外来因素持续作用于肝脏时可激活HSCs(Gabele,Brenneretal.2003)。在急性肝损伤时，HSCs增殖后表型发生改变，转为移行细胞，合成基质蛋白以利组织修复。其后当刺激解除时，细胞表型回复，且可能通过凋亡机制使细胞数量也恢复正常。在慢性肝损伤时，HSCs通过复杂的机制而持续激活、增殖，并且发生显著的表型转化，变为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)(BatallerandBrenner2005)。在血吸虫虫卵肉芽肿边缘存在大量HSCs(Bartley,Rammetal.2006)，活化后在组织中表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，合成大量的ECM，如I型胶原(CollagenI)和III型胶原(CollagenIII)等(Friedman2008)。目前对于血吸虫感染诱导肝纤维化的机制还不十分明了，研究表明病原诱导的宿主免疫应答是刺激HSCs活化的关键环节，而细胞因子则是其中的信号传递者。在血吸虫病虫卵肉芽肿、肝纤维化过程中，宿主免疫应答类型逐渐呈现Th1向Th2极化，虫源蛋白通过各种细胞及细胞因子参与肉芽肿反应、纤维化形成的调节(deJesus,Magalhaesetal.2004,Wynn2004,Caldas,Campi-Azevedoetal.2008,Anthony,Allenetal.2010)。白介素-32(interleukin-32,IL-32)是一个促炎症细胞因子，已知IL-32有6种剪接异构体(splicingisoform)，IL-32γ是其中生物活性最强的亚型(Goda,Kanajietal.2006,Choi,Baeetal.2009)。IL-32可在多种细胞和组织中表达，活化的T细胞和NK细胞是其主要来源，脾脏、肝脏等组织里都有IL-32的表达。在上皮细胞中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-1β和IL-18等能够刺激IL-32的表达(DinarelloandKim2006)。研究表明重组IL-32(recombinantIL-32,rIL-32)能够在多种细胞(尤其是单核细胞、巨噬细胞和外周血单个核细胞)中激活IL-8、TNF-α、MIP-2(macrophageinflammatoryprotein-2)等炎性细胞因子的表达(Kim,Hanetal.2005)。研究揭示，polyI:C可刺激NK细胞活化，活化的NK细胞能负调控日本血吸虫虫卵引起的肝纤维化，这种负调控是通过刺激产生抗纤维化因子IFN-γ和NK细胞对活化肝星状细胞的杀伤实现的(Hou,Yuetal.2012)。活化的NK细胞是IL-32主要来源细胞，且polyI:C、IFN-γ和IL-32的表达关系密切(Kim,Hanetal.2005)。此外，重组IL-32可以刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α(Kim,Hanetal.2005)，而TNF-α也与血吸虫病肝肉芽肿和纤维化密切相关(Booth,Mwathaetal.2004)。研究表明，IL-32和IL-17能够相互作用(Moon,Yoonetal.2012)，而IL-17可以通过多种信号途径诱导肝纤维化(Meng,Wangetal.2012)。综上所述，IL-32与诸多调控纤维化的细胞及细胞因子密切相关。但IL-32在日本血吸虫病肝纤维化中的作用目前未见报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用、基因IL-32在制备监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的药物中的应用、基因IL-32在制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物方面的应用。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。进一步的，一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：(1)、实验动物及其分组(1-1)选取36只6-8周龄的雌性ICR小鼠；将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只；(1-2)其中，A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组；B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次；C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次；分别于感染后6周、12周取样进行相关检测；(2)、实验小鼠取样(2-1)在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样；(2-2)待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上；(2-3)75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏；(2-4)在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中；(2-5)肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白；(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原变化：使用天狼星红染色盒试剂盒进行染色(3-1)10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水；(3-2)weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟；(3-3)酸性分化液分化5-10秒；(3-4)自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次；(3-5)天狼星红染色液滴染1小时，流水冲洗，去除切片表面染料；(3-6)常规脱水透明，中性树胶封固；(3-7)光学显微镜下观察拍照；(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达(4-1)取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5mlEppendorf管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。


2.根据权利要求1所述的一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：
(1)、实验动物及其分组
(1-1)选取36只6-8周龄的雌性ICR小鼠；将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只；
(1-2)其中，A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组；B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次；C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次；分别于感染后6周、12周取样进行相关检测；
(2)、实验小鼠取样
(2-1)在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样；
(2-2)待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上；
(2-3)75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏；
(2-4)在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中；
(2-5)肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白；
(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原：使用天狼星红染色盒试剂盒进行染色(3-1)10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水；
(3-2)weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟；
(3-3)酸性分化液分化5-10秒；
(3-4)自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次；
(3-5)天狼星红染色液滴染1小时，流水冲洗，去除切片表面染料；
(3-6)常规脱水透明，中性树胶封固；
(3-7)光学显微镜下观察拍照；
(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达
(4-1)取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5mlEppendorf管中，立即加入1mlTRIzol，在冰上用塑料棒对组织进行研磨；
(4-2)按照TRIzol的说明书进行操作，最终提取肝组织总RNA用200ulnuclease-free水溶解；
(4-3)用NanoDrop2000测定RNA的浓度；
(4-4)取5ug总RNA，使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应，逆转录引物使用Oligo(dT)18；
(4-5)逆转录产物即为各个样品的cDNA；
(4-6)以得到的cDNA为模板，使用Eco实时定量PCR仪进行RT-qPCR；
引物如下，GAPDH，F：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟，范义辉，孙晓雷，冯金荣，段义农，庄重，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32