测试试剂盒和测定制造技术

本发明专利技术提供了可用于筛选测试样品中配体存在的体外测试试剂盒、测定和方法，所述配体的特征在于其在细胞中时与类固醇激素受体形成复合物并引起基因组应答的能力。有利地，形成本文所述的测试试剂盒和方法的基础的基于活性的测定特别适用于检测未知结构的配体的存在，例如，马、犬和人类运动员在运动兴奋剂使用中使用的设计药物。公开了不同的测定原型，其中例如通过报道子的激活，可以检测到通过配体结合相互作用引起的激素受体激活。在某些实例中，本发明专利技术提供了涉及适体:荧光团报告子构建体的测试试剂盒、测定和方法，用于检测来自(例如)赛道旁采集自运动员的样品中的配体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测试试剂盒和测定
本专利技术总体上涉及用于检测测试样品中配体的测定、方法和测试试剂盒。特别地，本专利技术提供了筛选测试样品中配体存在的测定、方法和测试试剂盒，所述配体的特征在于在细胞中时与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答的能力。专利技术背景结合类固醇激素受体蛋白的配体的检测在许多领域中都是重要的，包括，例如，针对可能影响人类健康的有机污染物的环境测试、针对人类疾病的诊断和预后测试，包括(例如)内分泌-和非内分泌-癌的检测和/或监测，以及药物测试，包括负责维持(例如)人类运动员和赛马行业的公平竞争的专业体育组织。检测结合类固醇激素受体蛋白的配体的存在的常用方式是直接测量样品中的配体。然而，样品常常是分子的复杂混合物并且通常需要复杂的准备过程用于分析。检测样品中配体的存在通常依赖于如液相或气相色谱这样的过程，以从复合混合物将分子物质分离成相对纯的组成部分，随后用结构灵敏性方法(如质谱)来分析每个部分。自动化纯化系统、气相或液相色谱和质谱是昂贵的并且是必需由受过培训的技术人员不断校准和操作的技术上复杂的实验室仪器，以产生可靠的结果。另一个缺点是这种方法不提供关于配体生物活性的信息并且因此不能区分生物活性和生物无活性配体分子。另外，这种基于结构的方法不能区分激动剂和拮抗剂。此外，由于配体的生物代谢，常常需要配体及其相关的代谢物的分子结构的在先知识以获得样品中配体存在的可靠鉴定。除了基于光谱的检测方法，已经研发了一些基于细胞的测定，用于检测结合类固醇激素受体蛋白的配体的存在。然而，存在明显的与这些基于细胞的测定相关的局限性，其还需要专门的设备和专业知识来维持活细胞培养。这增加了基于细胞的测试的成本并减少了这些方法的广泛应用。此外，活细胞高水平的分子复杂性使得测试变得困难并且降低了灵敏度和可重复性。在用于分析的样品中，检测结合类固醇激素受体并调节基因表达的配体分子的存在常常是有利的。例如，结合雄激素受体并引发基因组应答的配体与合成代谢生长效应相关。动物和人类中的合成代谢生长就(例如)肌肉质量、骨骼重塑、血液产生升高、食欲和强度增加、调节、耐力和恢复锻炼而言提供了优势，而且还可以是疾病的指示。出于以下原因，包括：检测涉及动物(如赛马和狗)以及人类和人类运动员的禁药使用；检测食物或食物补充剂中禁用的添加剂；检测禁止的用于刺激用于食物的动物生长的配体的存在，例如，涉及牛、绵羊、猪、鸡和鱼；筛选药物；评估健康状况，检测结合雄激素受体并引起合成代谢效应的配体的存在在监测生物样品中具有特别的工业应用。类固醇激素受体含有特异性结合分子配体的结合结构域，其引起类固醇激素受体-配体复合物，引发各种细胞应答，包括基因组应答，其中基因的表达受类固醇激素受体直接调节。本专利技术具体地涉及检测配体的存在和/或效力，所述配体的特征在于在细胞中时通过与类固醇激素受体的结合直接调节基因表达的能力。专利技术概述本文描述和要求保护的专利技术具有许多属性和实例，包括，但不限于，这个专利技术概述中列出或描述或提及的那些。并不意图涵盖一切并且本文描述和要求保护的专利技术不限于这个专利技术概述中鉴定的特征或实例或不受这个专利技术概述中鉴定的特征或实例限制，包括其仅用于说明的目的，而非限制。在本专利技术的一个方面中，提供了用于筛选测试样品中配体存在的测试试剂盒，所述配体在细胞中时能够与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答，所述测试试剂盒包含：(i)与来自测试样品的配体形成受体-配体复合物的类固醇激素受体；和(ii)被受体-配体复合物结合的核酸应答元件；和(iii)用于检测受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合的检测工具其中，将样品与测试试剂盒结合并检测到受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合时，测定测试样品中配体的存在。在根据本专利技术的这个方面的实例中，测试试剂盒中类固醇激素受体与核酸应答元件的相对含量为x:1，其中x是类固醇激素的含量并且定义为[0.2≤x≤20]。在相关实例中，测试试剂盒中类固醇激素受体与核酸应答元件的相对含量为x:1，其中x是类固醇激素受体的含量并且定义为[0.3≤x≤7]。在根据本专利技术的这个方面的实例中，如本文所述的，测试试剂盒进一步包含至少一种类固醇激素受体辅因子、类固醇代谢机构(machinery)、转录和/或翻译机构和/或无细胞提取物。在相关实例中，类固醇激素受体辅因子选自热休克蛋白(HSP)(包括但不限于热休克蛋白70、热休克蛋白40、热休克蛋白90)、p23、热休克蛋白组织蛋白(Hop)、48kDHip蛋白、p60和FKBP52中的一种或多种。在根据本专利技术的这个方面的再一个相关实例中，测试试剂盒进一步包含HSP90。在根据本专利技术的这个方面的另一个实例中，核酸应答元件可操作地连接报道子构建体，并且通过测量报道子构建体的转录或翻译来检测受体-配体复合物与核酸应答元件的结合。在另一个实例中，报道基因构建体由启动子序列和报道基因组成。在再一个实例中，受体-配体复合物结合核酸应答元件时，激活从启动子序列的转录。在再一个实例中，报道子构建体包含编码能够结合荧光团的RNA适体的序列。在相关实例中，在荧光团与RNA适体结合时检测到荧光团的荧光的情况中，通过RNA适体的转录检测受体-配体复合物与核酸应答元件的结合。在再一个实例中，报道子构建体选自编码任何蛋白质或多肽的基因、不编码蛋白质或多肽的基因和编码或不编码蛋白质或多肽的合成核酸序列。在相关实例中，报道子构建体选自编码荧光蛋白(包括，但不限于，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)的基因或核酸序列，编码β-半乳糖苷酶(包括但不限于LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、碱性磷酸酶、荧光素酶的基因，氨基酸生物合成基因，例如，酵母LEU2、HIS3或LYS2基因，核酸生物合成基因，例如，URA3或ADE2基因，氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因，或其特异性抗体可利用的任何表面抗原基因。在另一个实例中，测试试剂盒进一步包含翻译和/或转录机构，以促进报道子构建体的转录和/或翻译。在再一个实例中，使用包括但不限于光学方法、光谱、可见光谱、拉曼光谱、UV光谱、表面等离子体共振、电化学方法、阻抗、电阻、电容、质量变化引起的机械传感、机械共振的变化、电泳、凝胶电泳、凝胶阻滞、成像、荧光、荧光共振能量转移、聚合酶链反应(PCR)定量PCR(也称为实时PCR、qPCR)，逆转录PCR(RT-PCR)和逆转录qPCR(RTqPCR)的方法来检测受体-配体复合物与核酸共振元件的结合。在本专利技术的另一个方面中，提供了用于筛选测试样品中配体存在的测试试剂盒，所述配体在细胞中时能够与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答，所述测试试剂盒包含：(i)与来自测试样品的配体形成受体-配体复合物的类固醇激素受体；和(ii)被受体-配体复合物结合的核酸应答元件；和(iii)用于检测受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合的检测工具其中测试试剂盒中类固醇激素受体与核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于筛选测试样品中配体存在的测试试剂盒，所述配体在细胞中时能够与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答，所述测试试剂盒包含：/n(i)与来自测试样品的配体形成受体-配体复合物的激素受体；和/n(ii)被受体-配体复合物结合的核酸应答元件；和/n(iii)用于检测受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合的检测工具；和任选/n其中，将样品与测试试剂盒结合并检测到受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合时，测定测试样品中配体的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180827 NZ 745713;20171103 US 62/581,260;201801081.一种用于筛选测试样品中配体存在的测试试剂盒，所述配体在细胞中时能够与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答，所述测试试剂盒包含：
(i)与来自测试样品的配体形成受体-配体复合物的激素受体；和
(ii)被受体-配体复合物结合的核酸应答元件；和
(iii)用于检测受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合的检测工具；和任选
其中，将样品与测试试剂盒结合并检测到受体-配体复合物与核酸应答元件之间的结合时，测定测试样品中配体的存在。


2.根据权利要求1的测试试剂盒，其中测试试剂盒中类固醇激素受体与核酸应答元件的相对含量为x:1，其中x是类固醇激素受体的含量并且定义为[0.2≤x≤20]。


3.根据权利要求1或权利要求2的测试试剂盒，其中测试试剂盒进一步包含类固醇激素受体辅因子，其防止类固醇激素受体结合核酸应答元件。


4.根据权利要求3的测试试剂盒，其中类固醇激素受体辅因子选自热休克蛋白70、热休克蛋白40、热休克蛋白90、p23、热休克蛋白组织蛋白(Hop)、48kDHip蛋白、p60和FKBP52。


5.根据权利要求1至4任一项的测试试剂盒，其中核酸应答元件可操作地连接报道子元件，并且通过研究报道子元件的转录或翻译来测定受体-配体复合物与核酸应答元件的结合。


6.一种用于筛选测试样品中配体存在的测试试剂盒，所述配体在细胞中时能够与类固醇激素受体形成复合物并引发基因组应答，所述测试试剂盒包含：
(i)与来自测试样品的配体形成受体-配体复合物的激素受体；和
(ii)被受体-配体复合物结合的核酸应答元件；和
(iii)可操作地连接核酸应答元件的报道子构建体；和任选
(iv)类固醇激素受体辅因子、转录机构、类固醇代谢机构和/或无细胞提取物
其中，当受体-配体复合物与核酸应答元件结合时激活报道子构建体，并且
其中，将样品与测试试剂盒结合并检测到报道子构建体的转录时，测定样品中配体的存在。


7.根据权利要求6的测试试剂盒，其中测试试剂盒中类固醇激素受体与核酸应答元件的相对含量为x:1，其中x是类固醇激素受体的含量并且定义为[0.2≤x≤20]。


8.根据权利要求6或权利要求7的测试试剂盒，其中类固醇激素受体辅因...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·K·希瑟，S·J·索尔比，
申请(专利权)人：奥塔哥创新有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ