制备冻干血小板的方法及其应用技术

本文提供了一种制备冻干血小板的方法，其包括：1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。本文还提供了该方法制备的冻干血小板和冻干血小板的用途。本文提供的冻干血小板可在长期保存时保持血小板抗原活性，为抗筛血小板的应用及血小板抗体检测试剂盒的标准化应用提供了解决方案。

【技术实现步骤摘要】
制备冻干血小板的方法及其应用
本文涉及制备冻干血小板的方法，尤其是制备可用于血小板抗体筛查的冻干血小板的方法。
技术介绍
血小板抗体是机体对血小板表面或相关抗原免疫产生的抗体，刺激血小板抗体产生的抗原可以是自身的也可以是异体的。血小板抗体有两类，一类主要是针对人类组织相容性抗原(HLA)I类抗原的抗体，即血小板表面相关抗体(PAIgG),一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体(PBIgG)。GP抗原和HLA-I类抗原刺激机体产生同种免疫反应，导致的外源性血小板破坏使血小板寿命缩短和功能改变，是血小板输注无效的重要原因。随着输注次数及量的增加，检出血小板抗体的阳性率增高，发生输注无效及非溶血性输血反应率也增高。准确、快速、简便地检测和鉴定出血小板抗体对血小板免疫性疾病的诊断、治疗等方面起着重要的作用。目前临床上血小板抗体检测的主要方法是以免疫学方法为主，但因为血小板表面抗原的复杂性和多样性，到目前为止没有商品化的纯抗原销售。在当前的检测中多使用血小板本身来提供抗原。目前血小板的保存存在以下问题：1、血小板在液态环境下极易发生聚集并丢失其抗原性，保存效期短；2，冻干血小板都以输注及治疗(伤口愈合)为目的的，缺乏对于血小板表面抗原的保护，在冻干过程中血小板表面抗原破坏较大，导致这类产品在血小板抗体筛查应用上存在众多问题，例如灵敏度低，阳性率低。
技术实现思路
一方面，本文提供了制备冻干血小板的方法，该方法包括：1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。在一些实施方案中，所述预处理液还包括海藻糖、山梨醇、吐温-20和EDTA。在一些实施方案中，所述预处理液为包括如下成分的缓冲液：海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-0.5％(v/v)吐温-20；以及2-30mMEDTA。在一些实施方案中，所述预处理液的配制方法为：向每升缓冲液中加入NaCl8g、海藻糖20g、赖氨酸25g、胶原15g、山梨醇5g、吐温-202mL以及EDTA1.8g。在一些实施方案中，所述固定液中戊二醛与乙醇的体积比为1：8。在一些实施方案中，所述冻干保存液为包括如下成分的缓冲液：1-6％血清白蛋白、0.1-1.5％PVP、以及0.5-5％甘露醇。在一些实施方案中，所述冻干保存液的配制方法为：向每升缓冲液中加入40g血清白蛋白、12gPVP、以及18g甘露醇。在一些实施方案中，步骤1)包括：以所述预处理液将血小板配制为108-1010个/mL的第一血小板悬液，并根据所述第一血小板悬液的体积加入1/10-1/4体积的所述固定液，在室温反应0.5-1小时。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤1)之前以含EDTA或柠檬酸的磷酸缓冲液对所述血小板进行清洗。在一些实施方案中，在步骤1)和步骤2之间还包括以含EDTA或柠檬酸的磷酸缓冲液对经步骤1)处理的血小板进行清洗。在一些实施方案中，步骤2)还包括在所述冻干前以所述冻干保存液将经步骤1)处理的血小板悬浮为108-1010个/mL的第二血小板悬液。在一些实施方案中，步骤2)中所述冻干在冻干机中抽真空进行，所述冻干机的冷阱温度设为-45±5℃，真空度设为<133mbar，真空冻干24h以上。在一些实施方案中，步骤2)中所述冻干包括：将所述第二血小板悬液转移至冻干瓶中，于-80℃超低温预冻过夜，次日转入己预冷的冻干机进行真空干燥，冷阱温度设为-45±5℃，真空度设为<133mbar，真空干燥24h后取出。另一方面，本文提供了上述方法制备的冻干血小板。另一方面，本文提供了包括上述冻干血小板的检测试剂盒。另一方面，本文提供了上述冻干血小板或上述检测试剂盒在血小板抗体筛查中的应用。本文提供的冻干血小板可在长期保存时保持血小板抗原活性，为抗筛血小板的应用及血小板抗体检测试剂盒的标准化应用提供了解决方案。附图说明图1显示了使用实验组冻干血小板样品配合商品化试剂盒检测盒内阴性和阳性质控品的检测结果。具体实施方式除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。除非另有说明，本文中所用的细胞生物学或免疫学操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供一些术语的定义和解释。用语“包括”指可添加除具体提及的那些步骤或成分之外的其他步骤或成分，只要这些另外添加的步骤或成分不影响原方法或组合物本身的功能。术语“血小板”具有领域通常理解的含义，指从巨核细胞脱落下来的小块，无细胞核，表面有完整的细胞膜。血小板大小差异比较大，大多在直径1-8微米。血小板因能运动和变形，故用一般方法观察时表现为多形态。血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。本文所用的血小板可以来自各种哺乳动物，优选人血小板。可以采用各种途径获得的血小板，例如单采血小板(也称为机采血小板)或从全血分离的血小板。优选地，所用的血小板为新鲜血小板，例如在使用前保存不超过一周，或不超过3天，最优选不超过1天。术语“冻干血小板”指经过冻干处理获得的血小板。其通常失去其生理状态下水分含量的90％，或甚至95％以上。冻干血小板在使用前可通过含水溶液再水化(或称为复水化)，以恢复其试验或临床上所需的功能。术语“缓冲液”指能在一定程度上抵消、减轻外加酸或碱对溶液酸碱度的影响的液体，通常为弱酸及其盐或弱碱及其盐组成的混合溶液。常用的缓冲液例如有磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、巴比妥缓冲液、醋酸缓冲液等等。这些缓冲液的配制方法在本领域内是公知的。术语“检测试剂盒”指包括用于特定检测目的的一种或多种试剂的包装盒或其他包装形式。其中的试剂可以存在于各个独立的容器中。除了用于检测目的的试剂之外，检测试剂盒还可以包括各种缓冲液、阴性或阳性对照试剂、标准品等。另外，在检测试剂盒中一般还包括用于阐述其中的试剂的使用方法的说明书。在本文中，除非另有说明，以百分比表示的成分含量为重量百分比含量。本文提供的制备冻干血小板的方法可包括以下步骤。步骤一：血小板预处理：将血小板使用基础缓冲液清洗3遍除去血浆等成分，使用预处理液重悬为细胞浓度为108-1010个/mL的悬液，根据悬液体积加入1/10-1/4体积的固定液，室温反应0.5-1小时，对悬浮细胞进行固定。基础缓冲液：磷酸缓冲液，含EDTA或柠檬酸等抗凝剂，pH6.5-7.5预处理液：磷酸缓冲液(或HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液)，pH6.5-7.5，含海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备冻干血小板的方法，包括：/n1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及/n2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，/n其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。/n

【技术特征摘要】
1.制备冻干血小板的方法，包括：
1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及
2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，
其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述预处理液还包括海藻糖、山梨醇、吐温-20和EDTA。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述预处理液为包括如下成分的缓冲液：海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-0.5％(v/v)吐温-20；以及2-30mMEDTA。


4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预处理液的配制方法为：向每升缓冲液中加入NaCl8g、海藻糖20g、赖氨酸25g、胶原15g、山梨醇5g、吐温-202mL以及EDTA1.8g。


5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述固定液中戊二醛与乙醇的体积比为1：8。


6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述冻干保存液为包括如下成分的缓冲液：1-6％血清白蛋白、0.1-1.5％PVP、以及0.5-5％甘露醇。


7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述冻干保存液的配制方法为：向每升缓冲液中加入40g血清白蛋白、12gPVP、以及18g甘露醇。


8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤1)包括：以所述预处理液将血小板配制...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，王秀柱，黄志刚，王伟权，潘大地，
申请(专利权)人：天津德祥生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12