基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括PCR引物对和探针，2x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase‑Free ddH

【技术实现步骤摘要】
基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法
本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法。
技术介绍
白血病是一组危及生命的血液和骨髓恶性疾病。在青少年和年轻人中，急性白血病最为普遍，慢性髓系白血病少见。其诊断治疗及预后需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行MICM综合分析，分子生物学角度主要检测的是基因表达、融合基因以及基因变异，基因变异中又以点突变、拷贝数的变异(扩增/缺失)为主，而基因PAX5、IKZF1拷贝数异常是B-ALL中最常见的变异。急性淋巴细胞白血病(ALL)现在已经超过80％，但是目前的治疗有明显的毒性作用，20％的患者在最初的治疗后复发。而ALL中的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是儿童(0-14岁)最常见的肿瘤，占所有婴儿和儿童白血病的70％，同样也影响着成年人。B-ALL是一种复杂的获得性遗传疾病，在调节造血、细胞周期和细胞增殖的基因中存在多种病变。在B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中，越来越多权威文献报道对正常B细胞发育至关重要的转录因子经常发生突变，PAX5和IKZF1拷贝数异常对B-ALL具有高度特异性，可作为B-ALL的分子诊断标记之一。转录因子PAX5和IKZF1在调节正常B淋巴细胞分化中起着重要作用。PAX5转录因子又称B细胞特异激活蛋白(BSAP)，是PAX家族的9个成员之一，是B细胞发育的主要调控因子，该因子的表达主要参与了B细胞分化中免疫球蛋白基因重排、BCR信号转导和B细胞存活，PAX5缺失或失活突变可导致B细胞前期细胞停滞。PAX5在B细胞前体中的表达对B细胞的正常分化和成熟至关重要。约有三分之一的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者在恶性细胞中获得PAX5杂合失活突变。PAX5基因的体细胞改变导致B细胞发育停滞，而生殖细胞PAX5突变与家族性B-ALL易感性有关。近年来，PAX5基因的点突变、片段缺失和各种重排在多种人类血液肿瘤中报道。然而，PAX5基因片段缺失与B-ALL之间有着密切的关系，中国当代儿科杂质中提及无特殊重现染色体异常B-ALL患者存在一定比例的PAX5基因片段缺失，该基因缺失往往提示患儿具有较高的白细胞水平及较短的缓解期。适当缩短化疗间期、加强化疗强度可能有望延长这部分患儿的缓解时间，为其争取更多的治疗机会，得到更加满意的治疗效果。IKZF1位于染色体7p12，编码淋巴细胞转录因子IKAROS。其两个主要领域:由外显子4-6编码DNA结合锌指结构和由外显子8编码锌指二聚作用。IKZF1整个基因(exon1-8)的缺失或部分外显子的缺失均会导致基因不完整，从而影响IKAROS表达不完全、显性失活或完全丧失的负效应。IKZF1缺失发生于大约15％的B-ALL患者中，在BCR-ABL1和Ph-like-ALL亚群中更为频繁，分别影响70％和40％以上的患者。IKZF1基因缺失与儿童和成人B-ALL的预后不良有关。由于其临床相关性，在过去研究中，IKZF1基因缺失已经成为一个B-ALL重要的预后生物标志物，并已经作为一项预测复发儿童和成人B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的重要检测。目前，对于检测PAX5和IZKF1基因片段缺失主要的检测技术有细胞遗传学技术以及分子生物学技术。细胞遗传学技术主要运用染色体核型分析及FISH技术检测；分子生物学技术主要运用高通量测序技术(NGS)全基因组分析、一代测序及荧光PCR(RT-PCR)技术。经典的细胞遗传学方法染色体核型分析和FISH有许多限制，阻止了进一步有效准确地对肿瘤基因组进行分析。次优染色体形态、低分辨率(300-500bp)和复杂的重排造成了染色体核型分析技术在识别基因特定区域的改变上比较困难，特别是在低年龄儿童组，细胞培养受到限制，即使是大体核型异常也未能核型分析检测到。而FISH商业化探针进行分析时部分病例中也可能会产生假阴性结果。运用高通量测序技术(NGS)全基因组分析高额的费用让普通患者望而却步，况且全基因组分析依赖于成熟的生物信息技术以及遗传解读经验。一代测序技术由于扩增局限于1kb左右的片段长度，无法对基因组大片段拷贝数变异进行检测，因此会产生假阴性。而荧光PCR(RT-PCR)技术快速、高效、高灵敏度及高特异性等优点，在临床上得到广泛推广应用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于，克服现有的技术中存在的缺陷，而提供一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒及方法，所要解决的技术问题是使其具有特异性好、灵敏度高并且高效快速、易于操作的优势，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术提供了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-17号试剂，所述1-17号试剂的每一个包含PCR引物对和探针，其中：该第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；该第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；该第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；该第4号试剂包含：用于扩增PAX5基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；该第5号试剂包含：用于扩增PAX5基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；该第6号试剂包含：用于扩增PAX5基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.16和SEQIDNO.17所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；该第7号试剂包含：用于扩增PAX5基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；该第8号试剂包含：用于扩增PAX5基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.22和SEQIDNO.23所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；该第9号试剂包含：用于扩增PAX5基因第9号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-17号试剂，所述1-17号试剂的每一个包含PCR引物对、探针，其中：/n该第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；/n该第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；/n该第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；/n该第4号试剂包含：用于扩增PAX5基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；/n该第5号试剂包含：用于扩增PAX5基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；/n该第6号试剂包含：用于扩增PAX5基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；/n该第7号试剂包含：用于扩增PAX5基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；/n该第8号试剂包含：用于扩增PAX5基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；/n该第9号试剂包含：用于扩增PAX5基因第9号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；/n该第10号试剂包含：用于扩增PAX5基因第10号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；/n该第11号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；/n该第12号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；/n该第13号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；/n该第14号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；/n该第15号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；/n该第16号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；/n该第17号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示，其探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-17号试剂，所述1-17号试剂的每一个包含PCR引物对、探针，其中：
该第1号试剂包含：用于扩增PAX5基因第1号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
该第2号试剂包含：用于扩增PAX5基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
该第3号试剂包含：用于扩增PAX5基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；
该第4号试剂包含：用于扩增PAX5基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
该第5号试剂包含：用于扩增PAX5基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；
该第6号试剂包含：用于扩增PAX5基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.16和SEQIDNO.17所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；
该第7号试剂包含：用于扩增PAX5基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；
该第8号试剂包含：用于扩增PAX5基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.22和SEQIDNO.23所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；
该第9号试剂包含：用于扩增PAX5基因第9号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.27所示；
该第10号试剂包含：用于扩增PAX5基因第10号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.28和SEQIDNO.29所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；
该第11号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第2号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.31和SEQIDNO.32所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；
该第12号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第3号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.34和SEQIDNO.35所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.36所示；
该第13号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第4号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.37和SEQIDNO.38所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.39所示；
该第14号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第5号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.40和SEQIDNO.41所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.42所示；
该第15号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第6号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.43和SEQIDNO.44所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.45所示；
该第16号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第7号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.46和SEQIDNO.47所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.48所示；
该第17号试剂包含：用于扩增IKZF1基因第8号外显子的引物对和探针，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.49和SEQIDNO.50所示，其探针的核苷酸序列如SEQIDNO.51所示。


2.根据权利要求1所述的基于荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐春花，张鹏，邢宽，何志健，谢珍，夏统前，袁鸣，何贵伦，安雪茹，李平，
申请(专利权)人：南京实践医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32