一种探针组合物及其在核酸原位检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，所述探针组合物包括环状探针和发夹探针；所述环状探针包括第一结合序列和非第一结合序列；所述发夹探针包括5’折叠序列、第二结合序列和3’结合序列；当所述发夹探针采用3’结合序列与5’折叠序列相互结合设计时，未与靶核酸结合时，形成茎环结构，发夹探针与靶核酸结合后，茎环结构打开，释放出3’结合序列互补结合在环状探针的部分或全部非第一结合序列上，发夹探针的3’结合序列作为滚环扩增的引物、环状探针作为滚环扩增的模板，进行滚环扩增反应，在原位核酸处得到含有大量重复序列的扩增产物，通过对重复序列进行检测和信号放大，实现了简单、灵敏、特异的核酸原位检测效果。

【技术实现步骤摘要】
一种探针组合物及其在核酸原位检测中的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，尤其涉及一种探针组合物、核酸原位检测试剂盒、核酸原位检测方法及其在制备疾病诊断试剂中的应用。
技术介绍
核酸原位检测技术是一种在细胞内检测核酸表达和分布的技术。随着PCR(PolymeraseChainReaction)和高通量测序的发展，将生物样本作为整体进行研究，获得的基因表达谱和基因表达量是整个生物样本的平均值，而组织中不同位置、不同功能的细胞的基因表达具有异质性，采用传统的方法无法获得这一差异，细胞间的差异淹没在了平均值中。而了解基因在不同功能细胞中的差异性表达，有助于精准揭示基因功能、准确研究疾病原因，为疾病的精准治疗提供有效方案。现有的免疫荧光、免疫组化、细胞流式等技术能够通过标记的抗体研究单细胞中的蛋白质，但是不适用于单细胞的核酸检测；同时，上述方法受到商品化抗体的限制，如果缺少特异性抗体，则很难对相应靶标进行检测；另外，此类方法也难以准确检测分泌型蛋白。单细胞测序是近年来新兴的研究单细胞基因表达的方法，但是将单细胞实验结果还原到组织结构中时，需要考虑组织位置分布及微环境对细胞基因表达的影响，单纯的单细胞测序结果仍然不能准确反映组织细胞的异质性。为了解决上述技术问题，核酸原位检测技术也得到了快速发展。核酸原位检测技术能够在组织切片中对不同细胞的基因表达情况进行检测，FISH(fluorescenceinsituhybridization)作为最经典的核酸原位检测技术，但存在耗时长、信号低、背景高、特异性差等缺点，研究人员在此基础上也逐渐开发出了许多新方法。WO2018175779A1、US20160108458A1利用滚环扩增的方式进行核酸的原位检测，设计的探针结合在靶核酸的相邻位置上，两条探针游离的一端供搭桥探针和成环探针结合，通过连接酶将搭桥探针和成环探针连接成闭合的环状序列后，以一条探针的3’端为引物、以形成的环状序列为模板，进行滚环扩增检测。上述两种方案虽然具有较好的特异性，但是需要加入搭桥探针和成环探针并进行连接反应，操作复杂，耗时较长。Wang等(TheJournalofMolecularDiagnostics,Vol.14,No.1,January2012)设计一对“Z”型探针结合在靶核酸的相邻位置上，体系中需要加入与两个“Z”型探针结合的延伸探针，供大量的检测探针结合，从而进行信号放大。该方法特异性好，但是探针设计复杂，影响了检测效率，且成本高。Larsson等(NatureMethods,Vol.7,No.5,May2010)利用LNA逆转录引物和逆转录酶将RNA逆转录为cDNA后，采用锁式探针识别靶序列，通过滚环扩增放大检测信号。但是该方法需要采用LNA逆转录引物识别目标mRNA并进行逆转录，LNA逆转录引物的合成成本高，逆转录过程延长了检测时间；另外，滚环扩增以cDNA的3’端为引物，因此一条cDNA链只能结合一个锁式探针进行扩增，信号放大程度受到限制。另外，Chen等(Science,Vol.348,Issue6233,April2015)设计多达96条探针进行原位检测，每条探针包含中间识别序列和两端的游离序列，探针复杂、成本较高，方法特异性弱。因此，有必要提供一种更加简便、高效、特异、低成本的核酸原位检测技术。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，采用环状探针和发夹探针组成的探针组合物与原位核酸互补结合，探针结构简单，反应过程中不需要进行连接反应，实现了快速、特异、准确、低成本的核酸原位检测。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种探针组合物，所述探针组合物包括环状探针和发夹探针；所述环状探针包括第一结合序列和非第一结合序列；所述发夹探针包括5’折叠序列、第二结合序列和3’结合序列；所述第一结合序列与靶核酸的第一结合位点互补；所述第二结合序列与靶核酸的第二结合位点互补；所述发夹探针的3’结合序列与所述环状探针中除第一结合序列的部分或全部序列互补。本专利技术中，环状探针和发夹探针依靠各自的结合序列结合在原位核酸处，结合序列的设计可以与靶核酸的序列具有70～100％的吻合程度。环状探针和发夹探针分别与靶核酸结合时，发夹探针的3’结合序列与相邻位置的环状探针的部分或全部非第一结合序列相结合，发夹探针的3’结合序列作为滚环扩增的引物、环状探针作为滚环扩增的模板，进行滚环扩增反应，在原位核酸处得到含有大量重复序列的扩增产物。本专利技术中，为进一步提高检测特异性，将发夹探针的5’折叠序列设计为能够与3’结合序列结合，形成茎环结构，在发夹探针未与靶核酸结合的情况下，发夹探针呈茎环结构，3’结合序列无法与环状探针结合，不发生滚环扩增反应；当发夹探针与靶核酸结合后，茎环结构打开，3’结合序列与环状探针结合，从而引发滚环扩增反应。另外，发夹探针也可通过自身序列互补折叠，将3’结合序列与第二结合位点部分序列互补，实现无靶核酸情况下，3’结合序列无法与环状探针结合，而有靶核酸情况下，能够释放出3’结合序列，与环状探针结合。SanjayTyagi等(NatureBiotechnology,Vol.14,March1996)研究表明，拥有茎环结构的分子信标具有极高的特异性，设计合理的分子信标甚至可以识别出单碱基的差异，当非特异核酸与靶核酸只存在单个碱基差异时，分子信标也不会打开茎环结构。因此采用5’折叠序列和3’结合序列互补结合的发夹探针能够显著提高检测特异性，可检测单碱基突变。同时，本专利技术通过扩增出的重复序列带来的信号放大，实现了简单、灵敏、特异的核酸原位检测效果。另外茎环结构打开后5’折叠序列可以与靶核酸互补结合，也可以呈游离状态作为检测探针的结合位点、与检测探针结合，增强检测信号。优选地，所述第一结合位点和所述第二结合位点相邻。本专利技术中，环状探针和发夹探针结合在靶核酸的相邻位置，只有当环状探针和发夹探针同时结合在靶核酸相邻位置，降低了3’结合序列与环状探针的结合难度，有利于发夹探针的3’结合序列特异、高效地互补结合在环状探针的非第一结合序列上，才能引发滚环扩增，从而更加提高了检测的特异性。优选地，所述第一结合位点位于所述第二结合位点的5’端或3’端，优选为所述第一结合位点位于所述第二结合位点的5’端。优选地，发夹探针未与靶核酸结合时，3’结合序列与5’折叠序列相互结合形成茎环结构，当发夹探针与靶核酸结合后，茎环结构打开。本专利技术中，当不存在靶核酸序列时，发夹探针的5’折叠序列与所述3’结合序列通过氢键结合或化学键结合，优选为5’折叠序列与所述3’结合序列通过Watson-Crick配对结合或通过Hoogsteen配对结合；当5’折叠序列与所述3’结合序列通过Hoogsteen配对结合时，可通过多聚鸟苷酸形成G-四链体(G-quadruplex)结构(A.Bourd本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括环状探针和发夹探针；/n所述环状探针包括第一结合序列和非第一结合序列；/n所述发夹探针包括5’折叠序列、第二结合序列和3’结合序列；/n所述第一结合序列与靶核酸的第一结合位点互补；/n所述第二结合序列与靶核酸的第二结合位点互补；/n所述发夹探针3’结合序列与所述环状探针的部分或全部非第一结合序列互补。/n

【技术特征摘要】
1.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括环状探针和发夹探针；
所述环状探针包括第一结合序列和非第一结合序列；
所述发夹探针包括5’折叠序列、第二结合序列和3’结合序列；
所述第一结合序列与靶核酸的第一结合位点互补；
所述第二结合序列与靶核酸的第二结合位点互补；
所述发夹探针3’结合序列与所述环状探针的部分或全部非第一结合序列互补。


2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述第一结合位点和所述第二结合位点相邻；
优选地，所述第一结合位点位于所述第二结合位点的5’端或3’端，优选为所述第一结合位点位于所述第二结合位点的5’端。


3.根据权利要求1或2所述的探针组合物，其特征在于，所述发夹探针的5’折叠序列与3’结合序列结合；
优选地，所述发夹探针的5’折叠序列与所述3’结合序列通过氢键结合或化学键结合；
优选地，所述通过氢键结合包括所述5’折叠序列与所述3’结合序列通过Watson-Crick配对结合或通过Hoogsteen配对结合；
优选地，所述5’折叠序列与所述3’结合序列通过Hoogsteen配对结合时形成G-四链体结构；
优选地，所述环状探针和发夹探针的部分或全部核苷酸修饰有核酸类似物；
优选地，所述核酸类似物包括LNA-DNA、LNA-RNA、2’-FRNA、2’-NH2RNA、2’-O-MeRNA或2’-O-MOERNA中的任意一种或至少两种的组合。


4.根据权利要求1-3任一项所述的探针组合物，其特征在于，所述环状探针采用有机合成反应制备得到；
优选地，所述环状探针采用酶连接反应制备得到；
优选地，所述酶连接反应包括：
人工合成与环状探针具有相同核酸序列的线性化核酸分子；
向所述线性化核酸分子中加入搭桥引物和连接酶，连接得到所述环状探针；
所述搭桥引物的两端分别与所述线性化核酸分子的两端互补结合，优选地所述搭桥引物的5’端与所述线性化核酸分子的5’端反向互补，所述搭桥引物的3’端与所述线性化核酸分子的3’端反向互补；
优选地，所述搭桥引物为DNA片段或RNA片段；
优选地，所述连接酶包括DNA连接酶和/或RNA连接酶；
优选地，所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶和/或SplintR；
优选地，所述RNA连接酶包括T4RNA连接酶；
优选地，所述线性化核酸分子的5’端修饰有磷酸基团；
优选地，所述线性化核酸分子的5’端通过有机合成修饰磷酸基团；
优选地，所述线性化核酸分子的5’端通过磷酸激酶修饰磷酸基团。


5.一种核酸原位检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括检测探针；
优选地，所述检测探针的序列与所述环状探针的部分序...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，章成，余旻斐，
申请(专利权)人：深圳百纳心致生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44