一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种准确、有效、稳定可行的检测细胞中染色体外基因序列和病毒基因的单拷贝数量和部位的方法，所述方法包括如下步骤：(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；(2)利用二级探针进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针序列特异性结合的核酸序列；(3)加入扩增探针，与二级探针相结合；(4)将与扩增探针相结合的标记探针进行杂交结合；(5)于荧光显微镜下进行镜检。

【技术实现步骤摘要】
一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法。
技术介绍
肿瘤是由原癌基因激活或者抑癌基因功能丢失引发的。最近的研究发现，大量的与癌症相关的基因并不在染色体上，而是会从染色体上脱落下来，变成一种大小为几百Kb到Mb不等的小型环状的DNA，而被称为染色体外DNA(extrachromosomalDNA，ecDNA)。染色体外DNA广泛存在于肿瘤细胞中，它们的拷贝数往往比较高，相应基因的RNA拷贝数也可能较高，而且随着细胞复制或药物治疗会发生动态变化，染色体外DNA有望成为肿瘤异质性的重要标志物，也可能成为肿瘤基因治疗和耐药性的重要标志物。染色体外DNA不仅存在于血液中，也被发现在其他体液包括胸腔积液中。染色体外DNA不仅和肿瘤相关，还可能是真核细胞内的一种应对危机的基因扩增机制，所以染色体外DNA也有可能存在于其他一些应对危机出现的细胞中，其重要性和应用途径也许非常广泛。传统的染色体核型加染色体外DNA的分析法，在没有抓住中期分裂相的细胞中，基本上检测不到染色体外DNA，在少量的循环肿瘤细胞中分析的可能性更加渺茫。DNA显微镜技术，由于单拷贝DNA/RNA的检测信号不够强，不能满足DNA数量和位置的精准要求。病毒感染的细胞中的病毒RNA或病毒DNA的原位检测，也遇到同样的问题。因此，本领域急需一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外DNA和RNA的单拷贝数量和部位的精准检测方法。专利技术内容针对现有技术的不足和市场需求，本专利技术的目的在于提供一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外基因序列的单拷贝数量和部位的方法。为了实现该目的，本专利技术提供的方法的步骤包括：(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；每个所述一级探针为与目标基因中部分核酸序列配对结合的核酸序列；所述目标基因序列包括DNA或RNA序列片段；(2)利用二级探针与步骤(1)所得物的一级探针的配对序列进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针的配对序列特异性结合的核酸序列；(3)向步骤(2)所得物加入扩增探针与二级探针相结合；所述扩增探针为生物素标记了的核酸探针；(4)将与扩增探针特异性结合的标记探针(如亲和素蛋白质)加入，并使之相结合；(5)于荧光显微镜下进行镜检。在步骤(1)当中，本专利技术通过与目标基因片段对应的三个一级探针结合，建立四个基因信号扩增点，从而使目标片段的特异性信号得以扩增，而非特异性结合信号不能扩增。本专利技术通过一级探针修饰释放出结合位点，建立比邻杂交后探针的架桥和扩增点，然后通过步骤(3)的信号扩增处理和步骤(4)的信号标记处理，之后便可以通过显微镜进行观察检测。在本专利技术中，如图1所示，三个一级探针中，一个作为靶点探针(一级探针1)，另两个作为特异性信号探针(一级探针2，3)。通常而言，脱离染色体的基因片段或环状基因片段，可能由于缺失其中一个特异性信号探针或者由于点突变或缺失等原因，有可能造成探针不能稳定结合(例如：一级探针1或一级探针2不能结合的情况)。由于本专利技术采用的是三个一级探针的设计，可形成2个与扩增架桥(如图1-5所述)和4个基因信号扩增点(如图6所示)，因此可以照常检测到靶点基因序列，包括特异性点热点突变。在本专利技术中，单个的一级探针，不能形成信号扩增部位，最终检测不到，只有特异性的基因序列得到信号扩增并可以被检测；这种核酸特异性序列信号扩增，只扩增特异性核酸序列，而不扩增非特异性的背景信号。在染色体中期相中，可以检测到染色体外的环状DNA，而在细胞涂片中，可以检测到包括DNA和RNA在内的相关基因或片段序列的数量。另外，在细胞涂片中，若设定染色体对照基因或片段序列，则可测出染色体外DNA数量以及在细胞中的位置(包括是否在细胞核内或细胞质内)。在步骤(3)中，所述扩增探针是在与二级探针结合的基础上，不断产生新的结合，扩增探针是信号标记了的探针，如被Biotin或荧光标记了的探针，或有Biotin标记进一步可与荧光标记了的Avidin蛋白质结合之类的。通过上述说明，不难知晓，本专利技术中的目的片段可以是一个，也可以是多个，所述的目的片段包括核糖核酸序列或脱氧核糖核酸的序列或靶点。所述靶细胞的染色体中期相或细胞涂片，指的是经过洗涤或固定、蛋白质酶处理后，可用于原位杂交的样本。作为本专利技术的一个实施方式，所述固定是利用甲醇或乙酸进行生物样本的固定；和/或，所述蛋白质酶处理是利用包括胃蛋白酶在内的蛋白酶进行所述杂交结合前的处理。作为本专利技术的一个优选技术方案，步骤(1)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：6倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液、25％W/W甲酰胺、0.2％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/LNaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠；和/或，步骤(2)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：2nmol/L二级探针的预扩增片段、20％W/W甲酰胺、5倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液、0.3％W/W十二烷基硫酸锂、10％硫酸葡聚糖和阻断液；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/LNaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠。作为本专利技术的一个优选技术方案，步骤(1)中，所述杂交的时间为3小时、温度为40℃；和/或，步骤(2)中，所述杂交时间为30分钟、温度为40℃。作为本专利技术一个实施方案，所述目的片段为表皮生长因子受体(epidermaIgrowthfactorreceptor，简称为EGFR)。所述三个一级探针的序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示；或者，所述三个一级探针的序列分别如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示。三个一级探针的序列具体分别为：一级探针1：一级探针2：一级探针3：或者，三个一级探针的序列具体分别为：一级探针1：一级探针2：一级探针3：作为本专利技术一个优选的技术方案，步骤(3)中，处理时间为15分钟，所述扩增因子的浓度为2nmol/L。作为本专利技术的一个优选的技术方案，步骤(4)中，进行所述杂交结合时，所述荧光标记探针为生物素，所用的杂交液为5倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液和0.3％W/W十二烷基硫酸锂；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/LNaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠。作为本专利技术的一个优选的技术方案，进行每个步骤的处理后均需要在室温下进行洗涤处理三次；进行所述洗涤处理时，所用的洗涤溶液为：0.1倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液和0.03％W/W十二烷基硫酸锂；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原位检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；每个所述一级探针为与目标基因中部分核酸序列配对结合的核酸序列；所述目标基因序列包括DNA或RNA序列片段；/n(2)利用二级探针与步骤(1)所得物的一级探针的配对序列进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针的配对序列特异性结合的核酸序列；/n(3)向步骤(2)所得物加入扩增探针与二级探针相结合；所述扩增探针为生物素标记了的核酸探针；/n(4)将与扩增探针特异性结合的标记探针加入，并使之相结合；/n(5)于荧光显微镜下进行镜检。/n

【技术特征摘要】
1.一种原位检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；每个所述一级探针为与目标基因中部分核酸序列配对结合的核酸序列；所述目标基因序列包括DNA或RNA序列片段；
(2)利用二级探针与步骤(1)所得物的一级探针的配对序列进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针的配对序列特异性结合的核酸序列；
(3)向步骤(2)所得物加入扩增探针与二级探针相结合；所述扩增探针为生物素标记了的核酸探针；
(4)将与扩增探针特异性结合的标记探针加入，并使之相结合；
(5)于荧光显微镜下进行镜检。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞的染色体中期相或细胞涂片，指的是经过洗涤或固定、蛋白质酶处理后，可用于原位杂交的样本。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定是利用甲醇或乙酸进行生物样本的固定；和/或，所述蛋白质酶处理是利用包括胃蛋白酶在内的蛋白酶进行所述杂交结合前的处理。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：
6倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液、25％W/W甲酰胺、0.2％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液；
所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/LNaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠；
和/或，
步骤(2)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：
2nmol/L二级探针的预扩增片段、20...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓亚光，
申请(专利权)人：宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42