一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法技术

本发明专利技术提供了及一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，属于海洋贝类细胞的分离技术领域。将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量浓度0.1％胶原酶Ⅳ溶液消化和质量百分浓度0.25％胰蛋白酶溶液消化，解离精巢获得单细胞悬液；配制体积浓度10％、22％和35％的Percoll溶液，按浓度由大到小的顺序装入同一离心管中，向离心管的顶层加入贝类生精细胞单细胞悬液，离心，分别收集3层细胞。采用两步酶解法可将精巢组织中的生精细胞成功解离为单细胞悬液，细胞存活率可高到96.62％，并可在体外进行正常培养。同时分离出较高纯度的精原细胞和精母细胞，为研究贝类配子发生和繁育机制提供重要的材料，具有较高的指导意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法
本专利技术属于海洋贝类细胞的分离
，具体涉及一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法。
技术介绍
生精细胞是雄性生殖细胞的统称，能够经过逐级分化形成精子，将遗传信息传递给后代，维持物种的稳定。生精细胞根据发育分化过程可以分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。生精细胞的研究一直是发育生物学和繁殖生物学的热点，生精细胞的体外分离和纯化，有利于探寻精子的发生机制，实现生精细胞的体外培养和移植。然而，由于生精细胞体积小、难辨认，在体外培养条件下难以分离出发育同步的生精细胞，因此对不同生精细胞进行分离是进行相关研究的基础。贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，对其生殖细胞发生和繁育机制的研究，将为贝类性控育种、生殖调控技术开发及新品种研发知识产权的保护提供重要的基础。截至目前国内外尚未建立贝类生精细胞的分离技术。栉孔扇贝(Chlamysfarreri)隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、珍珠贝目(Pterioida)、扇贝科(Pectinidae本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量百分浓度0.1％胶原酶Ⅳ溶液消化和质量百分浓度0.25％胰蛋白酶溶液消化，解离精巢获得贝类生精细胞单细胞悬液；/n2)配制体积浓度分别为10％、22％和35％的Percoll溶液，按浓度由大到小的顺序依次装入同一离心管中，向所述离心管的顶层加入步骤1)中所述贝类生精细胞单细胞悬液，离心，分别收集3层细胞至单独的容器中。/n

【技术特征摘要】
1.一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将增殖期贝类精巢破碎，依次用质量百分浓度0.1％胶原酶Ⅳ溶液消化和质量百分浓度0.25％胰蛋白酶溶液消化，解离精巢获得贝类生精细胞单细胞悬液；
2)配制体积浓度分别为10％、22％和35％的Percoll溶液，按浓度由大到小的顺序依次装入同一离心管中，向所述离心管的顶层加入步骤1)中所述贝类生精细胞单细胞悬液，离心，分别收集3层细胞至单独的容器中。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中增殖期贝类精巢的质量与胶原酶Ⅳ溶液和胰蛋白酶溶液的体积比为0.8～1.2g：10mL：10mL。


3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤1)中所述胶原酶Ⅳ溶液的消化时间为90min；
所述胰蛋白酶溶液的消化时间为10min。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦贞奎，王庆，张志峰，刘丹雯，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37