检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。使用本发明专利技术的胶体金试纸条检测卡氏住白细胞虫抗体，无需任何仪器和设备，肉眼就可判定结果。可在样品收集现场进行检测，特别适合野外或现场应用。检测步骤少，10‑15min出结果，特别适合大规模的检测和流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法。
技术介绍
卡氏住白细胞虫病又称“白冠病”，是由卡氏住白细胞虫寄生于鸡的红细胞、白细胞和内脏组织细胞内所引起的一种血孢子虫病。卡氏住白细胞虫病多发生于3～6周龄雏鸡，发病严重，死亡率高；青年鸡感染率比雏鸡高，但是死亡率不高；而成年鸡的感染率最高，但死亡率很低，症状较轻。主要临床症状表现为鸡冠苍白，消瘦，拉水样白色或绿色稀粪，鸡发育受阻，成年鸡产蛋下降甚至停止，会对养鸡行业造成较大经济损失。目前，卡氏住白细胞虫病的检测方法主要分为病原检查、血清学试验和核酸检测等。病原检查主要通过血涂片检查法检查外周血液中有无裂殖子或配子体。血涂片检查方法虽然简单易行，但是在检测效率、检出率、虫种鉴别等方面具有很大的局限性，越来越不适应当前防治工作的需要，尤其不能适应大规模的流行病学调查。核酸检测主要通过普通PCR方法和荧光定量PCR方法，此类方法敏感性好且准确性相对较高，但是需要专业的仪器设备进行检测，对人员和设备的要求较高。血清学检测方法有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、乳胶凝集试验等，这些方法存在着敏感性低或操作复杂、未标准化等问题。基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法具有良好的敏感性和特异性，但是需要专业的设备和操作人员，对试验条件要求较高，且检测耗时较长。因此，亟需一种敏感、特异、快速、可靠，适用于各养殖场和基层兽医站的卡氏住白细胞虫病检测技术。>
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法，是应用试纸条来检测卡氏住白细胞虫的方法，比现有的涂片镜检法和琼脂扩散试验更加敏感，其检测效率和检出率更高。与间接ELISA方法相比，本专利技术建立的用胶体金试纸条检测卡氏住白细胞虫抗体的方法，操作简单，不需要专业的仪器设备，试验时间更短，成本低，更加适用于现场检测和大规模的流行病学调查，有利于该病的防控。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。优选地，检测步骤与原理：将待测样本中的卡氏住白细胞虫抗体先与胶体金标记的重组R7蛋白抗原反应，再与硝酸纤维素膜上对应的重组R7蛋白抗原反应，形成重组R7蛋白抗原-卡氏住白细胞虫抗体-胶体金标记重组R7蛋白抗原夹心复合物，通过胶体金颗粒特有的颜色示踪而判断卡氏住白细胞虫抗体的有无。优选地，所述底板为PVC底板。优选地，所述重组R7蛋白(rR7蛋白)的制备方法：(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coliTOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coliBL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：A、金标垫的制备：(1)胶体金的制备：将氯金酸水溶液加入超纯水中，加热，再加入柠檬酸三钠水溶液搅拌，继续煮沸，冷却，定容，即获得胶体金溶液，避光保存备用；(2)金标重组R7蛋白的制备：用K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得纯化的金标重组R7蛋白溶液；(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液稀释，再喷涂在玻璃纤维膜上，烘干，得到金标垫，密封保存；B、反应垫的制备：(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成1.0-3.5mg/mL的检测线溶液和0.2-1.2mg/mL的质控线溶液，将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线，将质控线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，密封干燥保存，备用；C、试纸条的制备：(1)将样品垫在预处理液中浸泡，再烘干，干燥保存；(2)将底板、样品垫、金标垫、反应垫和为吸水垫组合，底板先粘上反应垫和吸水垫，反应垫与吸水垫相互交叠，且吸水垫在反应垫的上边，在反应垫的上边依次粘贴金标垫和样品垫，反应垫和金标垫之间以及金标垫与样品垫之间相互交叠，即得所述检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条。优选地，所述金标垫的制备中：氯金酸水溶液的质量百分数为0.5-2％，柠檬酸三钠水溶液的质量百分数为0.5-2％，BSA溶液的质量百分数为5-10％。优选地，所述氯金酸水溶液与超纯水的比值为1:(100-105)。优选地，所述金标垫的制备中：金标复溶液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖，1％海藻糖，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3。优选地，所述金标复溶液和原胶体金溶液的体积比为1:(18-20)。优选地，所述稀释所用的溶液为金标复溶液，所述金标重组R7蛋白溶液和金标复溶液的质量比为1:(1-4)。优选地，所述金标垫的制备中：喷涂的量为2-4μL/cm2，烘干的温度为35℃-37℃，时间为10-12h。优选地，所述离心的温度为4℃。优选地，所述反应垫的制备中：喷涂的量为2-4μL/cm2，烘干的温度为35℃-37℃，时间为10-12h。优选地，所述稀释液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含4％蔗糖和0.02％NaN3。优选地，所述检测线与质控线相距0.65-0.7cm，距硝酸纤维素膜的边距为0.9-1.0cm。优选地，所述预处理液为pH为7.4的0.015mol/LPBS；所述PBS，按质量分数计，含2％PEG，2％PVP，1％BSA，1％Tween-20和0.02％NaN3。本专利技术还提供更详细的一种检测卡氏住白细胞虫抗体胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：A、金标垫的制备：(1)胶体金的制备：将1％氯金酸水溶液加入100ml超纯水中，加热煮沸1-2min，加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml搅拌，继续煮沸10-15min，冷却，定容100ml，即获得胶体金溶液，避光保存备用；(2)金标重组R7蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：底板，以及设在底板上的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；所述金标垫为包被有胶体金标记的重组R7蛋白抗原的玻璃纤维膜，所述反应垫为包被有重组R7蛋白抗原的检测线和包被有兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜。


2.根据权利要求1所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述重组R7蛋白由如下方法制备而成：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coliTOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coliBL21表达菌，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。


3.权利要求1-2任一项所述的检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、金标垫的制备：
(1)胶体金的制备：将氯金酸水溶液加入超纯水中，加热，再加入柠檬酸三钠水溶液搅拌，继续煮沸，冷却，定容，即获得胶体金溶液，避光保存备用；
(2)金标重组R7蛋白的制备：用K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调至6.0-6.5，向胶体金溶液中加入重组R7蛋白，搅拌后静置，再加入BSA溶液封闭，搅拌静置，离心，取上清液，再离心，收集紫红色絮状沉淀，加入金标复溶液，混合，即得金标重组R7蛋白溶液；
(3)金标垫的制备：将金标重组R7蛋白溶液稀释，再喷涂在玻璃纤维膜上，烘干，得到金标垫，密封保存；
B、反应垫的制备：
(1)将重组R7蛋白和兔抗R7蛋白抗原多克隆抗体用稀释液分别稀释成1.0-3.5mg/mL的检测线溶液和0.2-1.2mg/mL的质控线溶液，将检测线溶液喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线，将质控线溶液喷涂于硝酸纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：邝春曼，谭志坚，王新秋，刘丽丹，翁亚彪，黄仪娟，
申请(专利权)人：佛山市正典生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44