针对癌细胞外泌体快速检测的试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，包括DNA四面体‑捕获适配体和信号适配体‑poly G，本发明专利技术引入DNA四面体纳米结构来改善捕获适配体的应用稳定性，将高特异性的核酸适配体与高灵敏性的核酸酶催化放大信号技术相结合，开发一种基于双核酸适配体的“夹心式”检测法核酸型试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒实现了对癌细胞外泌体的快速、准确定量，实现对外泌体的高灵敏、高通量检测，进而实现对宫颈癌的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
针对癌细胞外泌体快速检测的试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于临床诊断
，具体涉及一种基于酶联核酸适配体法的核酸型试剂盒。
技术介绍
肿瘤来源的外泌体(exosome)是30-100nm的有被小泡，在调控肿瘤发生和发展的过程中扮演重要角色，其表面携带大量的癌细胞来源的膜蛋白(肿瘤特异性分子)，在一定程度上是癌症生物标志物的富集体，具有较大的体外检测优势，可作为早期临床诊断的生物标志物。目前，外泌体的分析面临诸多问题：i)外泌体尺度在纳米级，难以使用流式细胞仪等细胞分析手段对其进行直接分析，而固定、标记等手段则导致灵敏度有限且可能破坏原有结构；ii)外泌体定量大多局限于SPR(表面等离子共振)或电化学等方法，需要特殊的仪器耗材，难以满足大量样本的高通量筛查。目前，诸如针对乙肝等疾病的诊断试剂盒大多基于抗原-抗体反应、酶联放大反应和96×酶标板，具备高通量筛查优势。但抗体制备过程复杂且易存在批次间差异，增加了实际应用难度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对癌细胞外泌体快速检测的试剂盒，并提供该试剂盒的制备方法，以及其具体应用，以弥补现有技术的不足。核酸适配体(aptamer)，也称适体、适配体，经体外SELEX技术筛选得到的单链寡核苷酸序列，具有高特异性、亲和性等优势，适配体可特异性地识别外泌体表面诸如CD63等靶蛋白而与外泌体结合。同时，适配体可无批次间差异合成，可接受不同的修饰标记或整合到核酸纳米结构中，达到高效识别，应用前景广阔。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术将高特异性的核酸适配体与高灵敏性的核酸酶联放大技术相结合，同时引入DNA四面体纳米结构来改善捕获核酸适配体的应用稳定性，开发一种基于双适体的“夹心式”检测试剂盒，以实现对癌细胞外泌体的高灵敏、高特异性以及高通量检测。具体为：一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，包括DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-polyG。进一步的，所述DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-polyG的浓度均为2μM。进一步的，上述试剂盒还包括氯化血红素(Hemin)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。所述DNA四面体-捕获适配体是指设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素(B)修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有B修饰，顶部带有捕获适配体的四面体纳米结构。所述信号适配体-polyG是指将信号适配体DNA序列与polyG序列连接得到的。上述试剂盒的制备方法包括：(1)制备DNA四面体-捕获适配体：首先设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素(B)修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有B修饰，顶部带有捕获适配体的DNA四面体结构；(2)在试剂盒的多孔板底部用链霉亲和素(SA)包被基础上，上述DNA四面体结构通过SA-B之间的特异性结合，使DNA四面体结构固定到多孔板的底部；(3)制备信号适配体-polyG，指将信号适配体DNA序列与polyG序列连接得到。上述试剂盒的使用检测方法包括：(1)将待检测样本处理之后加入至试剂盒的多孔板内，该多孔板固定有DNA四面体结构，若在外泌体存在的情况下，捕获适配体先与外泌体表面的CD63蛋白结合，去除上清液；(2)经洗板后，再加入信号适配体-polyG，其能够与外泌体表面的EpCAM蛋白结合，两条适配体与外泌体形成“夹心式”复合物，洗板；(3)然后，加入氯化血红素(Hemin)，polyG序列与Hemin形成过氧化物模拟酶，其发挥过氧化物酶(DNAzyme)活性，催化底物产生颜色变化；(4)再加入TMB，经过氧化物模拟酶催化TMB产生颜色变化，由无色变为蓝色，加酸中止后，由蓝色变为黄色，用酶标仪测量450nm处吸光值，即可实现对外泌体的可视化比色检测。进一步的，上述试剂盒的使用检测方法具体包括：(1)捕获适配体-DNA四面体纳米结构的构建及固定首先，分别向反应体系中加入2μM的四面体的四条链(a,b,c,d)，向体系中加入TM缓冲液(20mMTris,100mMNaCl,and5mMMgCl2,pH8.0)提供DNA自组装所需缓冲条件。然后采用“快速升温缓慢降温”的方法进行分子自组装，即在95℃下反应5min，使DNA链的二级结构打开，然后缓慢降温至25℃；将1μg/mL的SA均匀置于多孔板底部，过夜后洗板备用；然后将生物素化的DNA四面体2μM分别加入到含SA的多孔板内，室温下反应30min，然后洗板3次，除去未结合的DNA四面体，顶部含捕获适配体的DNA四面体被成功固定于多孔板上；(2)外泌体的比色检测将106个/mL的外泌体加入至含捕获适配体的多孔板内，4℃反应30min，捕获适配体识别外泌体表面的CD63蛋白，洗板3次；然后再分别向其中加入0.25,0.5,1,2,4μM的信号适配体，4℃反应30min，信号适配体识别外泌体表面的EpCAM蛋白，形成捕获适配体-外泌体-信号适配体“夹心式”结构，洗板3次；然后向靶标反应后的多孔板内加入40μM的Hemin，室温下反应15min形成DNAzyme，洗板3次；然后，向多孔板内加入100μL/孔的TMB，室温下反应15min后，加入2M硫酸50μL终止反应，可观察到溶液颜色先由无色变为蓝色，加酸后变为黄色，然后使用多功能酶标仪测量450nm处的光吸收值。所述“夹心式”双适体结构是指在靶标(外泌体)的诱导下，捕获适配体和信号适配体分别于外泌体表面的膜蛋白发生特异性识别，形成捕获适配体-外泌体-信号适配体复合体，其中上清液中未结合的信号适配体通过两相分离除去。上述试剂盒能够用于癌细胞外泌体的检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：首先，本专利技术与单样品检测相比，可实现高通量快速筛查，切合大量样本的筛查需求。其次，本试剂盒的识别因子、信号因子等均为核酸，可避免由于蛋白抗体易失活等限制。最后，DNA四面体结构的引入有助于固定化的适配体最大限度的发挥识别作用；双适体“夹心式”结构以及酶联放大技术的引入有助于提高检测的特异性和灵敏度，DNAzyme催化TMB产生颜色变化，不仅响应快速，而且能实现可视化的检测。本专利技术能实现对癌细胞外泌体的快速、准确定量。附图说明图1为本专利技术所提供诊断试剂盒的原理示意图；图2为本专利技术实施例中提取所得Hela-外泌体形态TEM表征结果图；图3为本专利技术实施例中DNA四面体-捕获适配体复合结构的折叠表征结果图；图4为本专利技术实施例中优化四面体-捕获适配体浓度的结果图；图5为本专利技术实施例中优化信号适配体-polyG浓度的结果图；图6为本专利技术实施例中外泌体的检测曲线和标准曲线结果图。具体实施方式以下通过具体实施例并结合附图对本专利技术进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-poly G。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-polyG。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-polyG的浓度均为2μM。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA四面体-捕获适配体是指设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有生物素修饰，顶部带有捕获适配体的四面体纳米结构。


4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述信号适配体-polyG是指将信号适配体DNA序列与polyG序列连接得到的。


5.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
（1）制备DNA四面体-捕获适配体：首先设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有生物素修饰，顶部带有捕获适配体的DNA四面体结构；
（2）在试剂盒的多孔板底部用链霉亲和素包被基础上，上述DNA四面体结构通过SA-B之间的特异性结合，使DNA四面体结构固定到多孔板的底部；
（3）制备信号适配体-polyG，指将信号适配体DNA序列与polyG序列连接得到。


6.权利要求1所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括：
（1）将待检测样本处理之后加入至试剂盒的多孔板内，该多孔板固定有DNA四面体结构，若在外泌体存在的情况下，捕获适配体先与外泌体表面的CD63蛋白结合，去除上清液；
（2）经洗板后，再加入信号适配体-polyG，其能够与外泌体表面的EpCAM蛋白结合，两条适配体与外泌体形成“夹心式”复合物，洗板；
（3）然后，加入氯化血红素，polyG序列与Hemin形成过氧化物模拟酶，其发挥过氧化物酶活性，催化底物产生颜色变化；
（4）再加入TMB，经过氧化物模拟酶催化TMB产生颜色变化，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王赛，亓晓燕，阎晓琛，赵连慧，黄云飞，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37