一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：模拟人体肺部环境。步骤：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂Tenax小棒，加入含有多种PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数；然后进行分离并处理，进行生物可给性的测定。由于本发明专利技术在模拟肺部环境的方法中加入了吸附剂，吸附剂的加入可以持续吸收污染物，使得颗粒物与模拟液之间一直保持着浓度梯度，污染物就会持续的从颗粒物中扩散到组织液中，体现了污染物溶解到组织液中是一个源源不断的吸收的过程，更好的模拟了人体吸收，利用组织液中污染物的过程，更准确的评估了污染物的生物可给性。

【技术实现步骤摘要】
一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法
本专利技术涉及一种生物可给性检测方法，具体涉及一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法。
技术介绍
人体暴露于环境中污染物的途径主要有三种，即呼吸暴露，膳食暴露和皮肤暴露。其中呼吸暴露是大气污染物进入到人体的主要途径之一。大气的迁移扩散，会使得大气中的各类污染物随之传输到各个地方，进而引起不同的环境污染问题，增加了人体经呼吸的污染物暴露风险，对人体健康产生潜在的危害。环境中的污染物分为有机污染物和无机污染物两种，例如在空气中含有硫氧化合物，氮氧化合物和碳氧化合物等无机污染物，也会有多环芳烃，二噁英等有机污染物。研究表明，人们若是长期置身于有机污染物浓度较高的环境中，会大幅度增加其患呼吸系统疾病的几率，并且有机污染物可以穿透胎盘，从而影响胎儿的健康，导致胎儿发育不良。因此大气中有机污染物对人体健康的危害是不容忽视的。大气中有机污染物主要形态为气态与颗粒态。颗粒态有机污染物是指吸附或粘附在大气悬浮颗粒物上的有机污染物。颗粒态有机污染物的含量与颗粒物粒径及性质相关，其在人体呼吸系统里的行为与颗粒物的相似。例如颗粒物的粒径大小不一，不同粒径的颗粒物在人体肺部的沉积效率也不同。大部分粒径大于10μm的颗粒物，在进入人体肺部之前，就会被鼻腔和咽喉截留住；而粒径在5－10μm的颗粒物在进入到咽喉部之后，可以在咽喉部通过物理机制去除；小于5μm的颗粒物则会经过咽喉部到达支气管；而小于2.5μm的颗粒物会通过呼吸进入肺部最深处。细颗粒(≤2.5μm)停留在空气中的时间相对较长，对有毒有害物质的吸附性更强，能在人体内呼吸系统的肺部沉积，沉积效率较高等，逐渐引起广大研究者的关注。研究表明，颗粒物上的毒害污染物经摄食或呼吸进入人体内，只有部分污染物将被解吸释放到人体的消化液，其中一部分能穿过细胞膜累积在人体器官并进行体内循环，从而产生健康风险。其中释放到消化液中污染物的量被称为生物可给性，而能穿过细胞膜被人体或生物体吸收而在体内循环的部分，称为生物可利用性。因此，采用毒害污染物的总浓度来评估其产生的健康风险，将会高估其风险值。目前多数风险评估方法正逐步由基于毒害污染物在样品基质的总浓度转换成其生物可利用或生物可给态浓度。理想情况下，可通过测定人体血液内毒害污染物的含量评估其生物可利用性，或一定条件下通过活体动物(如老鼠、猪或猴子)实验评估。然而，由于人体样品较难采集、活体动物实验耗费成本高且涉及伦理问题，多数研究者采用可通过体外模拟方法得到的生物可给性来替代生物可利用性进行风险评估。目前建立采用人体肺部模拟液评估颗粒态污染物经呼吸的生物可给性的体外方法都集中在重金属，对于有机污染物的研究甚少。经检索发现，国家知识产权局于2019年12月03日公开了公开号为CN110531056A的专利文献，一种土壤中六价铬呼吸途径的生物可给性测试方法，包括以下步骤；S1、将土壤样品风干，取出大块卵石及杂质，通过孔径为250μm的尼龙筛；S2、将上述处理后的土壤样品在温度为80℃的烘箱中烘干4h；S3、利用拍击式振筛机将烘干后的土壤样品连续通过40目、100目、140目、200目、270目和400目的筛子，持续振荡10min后最终得到粒径小于38μm的土壤样品，将其保存在塑料自封袋中用于土壤细颗粒样品的进一步分离；S4、利用实验室内的颗粒物再悬浮检测系统，采用PM2.5和PM10标准旋风式采样器，设置采样流量为16.7Lmin-1，空气动力学直径切割粒径分别为10μm和2.5μm，对上述样品进行进一步分离，获得粒径小于10μm和2.5μm的土壤PM10和PM2.5滤膜样品，并测定滤膜样品上六价铬的浓度ω(s)(mgkg-1)；S5、提前一天配置好模拟肺液，并在实验前放入烘箱中37℃条件下预热2h，模拟人体环境；S6、用不锈钢剪刀将土壤PM10和PM2.5滤膜样品剪碎放入50mL离心管中，加入50mL模拟肺液，混合后置于恒温37℃振荡箱中，设置振荡频率为50rpm；S7、振荡1h取出，将浸提液倒入真空抽滤装置中抽滤，滤膜孔径为0.45μm，收集抽滤液并测定抽滤液中六价铬的浓度ω(lb)(mgkg-1)；S8、测得的抽滤液中六价铬浓度ω(lb)(mgkg-1)与滤膜上六价铬浓度ω(s)(mgkg-1)的比值即为六价铬呼吸途径的生物可给性。S5中模拟肺液为一种无机和有机组成的混合溶液，其配置方法如下：选取氯化钠6786mgL-1、氯化铵535mgL-1、碳酸氢钠2268mgL-1、甘氨酸375mgL-1、二水柠檬酸钠59.3mgL-1、二水氯化钙29.4mgL-1、L-半胱氨酸121mgL-1、磷酸二氢钠144mgL-1、二乙基三胺五乙酸78.6mgL-1、烷基苄基二甲基氯化铵50mgL-1和硫酸27μL，按顺序依次溶解以上溶质，待完全溶解后加入下一种溶质，避免出现沉淀。所述S6中滤膜样品和模拟肺液之间的固液比分别设置在0.40－0.50gmL-1(PM10颗粒)和0.15－0.20gmL-1(PM2.5颗粒)范围内。所述S7中振荡提取时间分别设置在36-72h(PM10颗粒)和24-72h(PM2.5颗粒)范围内。由于实验室模拟中固液比不可能无限大，使得颗粒物与模拟液之间不能一直保持着相应的浓度梯度，所以上述专利文献的技术无法更准确的评估污染物的生物可给性。
技术实现思路
为了克服上述之不足，本专利技术的目的在于提供一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，该方法能更准确的评估污染物的生物可给性。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，包括：步骤A、模拟肺部环境：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂小棒，加入含有PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数。进一步地，还包括：步骤B、分离并处理：到达培养的天数后，取出玻璃瓶；先将吸附剂小棒从玻璃瓶中取出放入特氟龙离心管中，进行多次超声萃取并多次浓缩后，再经过层析柱净化，加入洗脱溶剂洗脱并浓缩后得到含有PAHs的吸附剂处理液；将玻璃瓶中的组织液滤出，对组织液进行多次液液萃取并多次浓缩后得到含有PAHs的模拟肺液处理液；再将过滤组织液后得到的颗粒物放入特氟龙离心管中，进行超声萃取、浓缩、置换溶剂、再次浓缩、经过无水硫酸钠及层析柱净化后，再经洗脱和浓缩后得到含有PAHs的颗粒物处理液。步骤C、检测：利用气相色谱质谱联用仪分别对含有PAHs的模拟肺液处理液、含有PAHs的吸附剂处理液、含有PAHs的颗粒物处理液进行检测，得到肺部组织液中PAHs的含量MY，吸附剂中PAHs的含量TA，没有释放到肺部组织液中，仍保留在颗粒物上PAHs的含量Mp。步骤D、生物可给性的测定：将上述检测到的值代入以下公式得到经呼吸的生物可给性(IBAF)进一步地，步骤A中，所述组织液为人工溶酶体或Gamble溶液；所述的人工溶酶体的pH值为3.5－4.5，模拟的是巨噬细胞吞噬颗粒时的肺部环境；所述的Gamble本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，包括：/n步骤A、模拟肺部环境：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂小棒，加入含有PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，包括：
步骤A、模拟肺部环境：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂小棒，加入含有PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数。


2.根据权利要求1所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，还包括：
步骤B、分离并处理：到达培养的天数后，取出玻璃瓶；先将吸附剂小棒从玻璃瓶中取出放入特氟龙离心管中，进行多次超声萃取并多次浓缩后，再经过层析柱净化，加入洗脱溶剂洗脱并浓缩后得到含有PAHs的吸附剂处理液；将玻璃瓶中的组织液滤出，对组织液进行多次液液萃取并多次浓缩后得到含有PAHs的模拟肺液处理液；再将过滤组织液后得到的颗粒物放入特氟龙离心管中，进行超声萃取、浓缩、置换溶剂、再次浓缩、经过无水硫酸钠及层析柱净化后，再经洗脱和浓缩后得到含有PAHs的颗粒物处理液。
步骤C、检测：利用气相色谱质谱联用仪分别对含有PAHs的模拟肺液处理液、含有PAHs的吸附剂处理液、含有PAHs的颗粒物处理液进行检测，得到肺部组织液中PAHs的含量MY，吸附剂中PAHs的含量TA，没有释放到肺部组织液中，仍保留在颗粒物上PAHs的含量MP；
步骤D、生物可给性的测定：将上述检测到的值代入以下公式得到经呼吸的生物可给性(IBAF)：





3.根据权利要求2所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤A中，所述组织液为人工溶酶体或Gamble溶液；所述的人工溶酶体的pH值为3.5－4.5，模拟的是巨噬细胞吞噬颗粒时的肺部环境；所述的Gamble溶液是加入了肺表面活性剂后的修正Gamble溶液，是pH为7.0－7.4的模拟液，模拟的是肺泡细胞间质液。


4.根据权利要求3所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤A中，所述吸附剂小棒中的吸附剂为Tenax，称为吸附剂Tenax小棒，具体制作的步骤为：称取1gTenax粉末置入圆筒中，圆筒的两端用特氟龙塞子塞紧，圆筒是由1000－2000目的不锈钢网制成，并用不锈钢丝将两端拧紧；颗粒物为加标沉积物，取适量的沉积物，烘干研磨过筛后，获得粒径小于200μm的颗粒物，然后加入多种PAHs的混合标样，搅拌均匀，加标后颗粒物中PAHs浓度为8－12μgg-1，加标后的颗粒物保存于2－6℃的冰箱中，老化一个月后再使用。


5.根据权利要求4所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤A中，取250mL玻璃瓶，分别加入200mL组织液，吸附剂Tenax小棒，20mg加标后的颗粒物，放入摇床中，温度为37℃，转速150rpm，培养10d。


6.根据权利要求5所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤B中，所述层析柱的制备：选取内径为0.8cm的层析柱，用脱脂棉将层析柱的下端封堵，填入并压实无水硫酸钠，在层析柱内的厚度为0.8－1.2cm，再填入并压实厚度为4.5－5.5cm的活化后的中性硅胶；所述活化后的中性硅胶为80－100目分析纯硅胶，该硅胶和脱脂棉的前处理均是先用滤纸包好，而后利用索式抽提器甲醇抽提48h后，取出放入真空干燥桶真空抽干；使用前，硅胶需在110℃烘箱中干燥活化4h，活化好的硅胶放入密封干燥桶中保存；无水硫酸钠在马弗炉450℃焙烧4h，冷却后取出，放入真空干燥桶中保存留用。


7.根据权利要求6所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍恋君，董莹，谢珊苡，曾永平，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44