一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法，包括如下步骤血浆样品预处理、将预处理后的血浆样品进行液相色谱分离、质谱测定、计算等步骤：本发明专利技术方法与现有技术相比，具有如下优势：(1)预处理方法简便。(2)专属性强。(3)灵敏度高：血浆最低定量限为2.5ng·mL

【技术实现步骤摘要】
一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法
本专利技术涉及一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法。
技术介绍
尼洛替尼是一种针对BCR-Abl，c-Kit，PDGFR，DDR和相关受体的酪氨酸激酶的口服抑制剂。临床上主要用于慢性髓细胞白血病(CML)的治疗。药物药代动力学以及生物等效性的研究均通过测定药物的药动学参数来评价，药物的检测分析显得非常重要。尼洛替尼生物样品的成分复杂、基体干扰大，同时样品较难获得而且量少，被分析物的浓度通常很低，因此对生物样品分离分析技术提出的要求越来越高，亟需建立一种高灵敏度、高选择性的尼洛替尼血浆浓度分析方法。LC-MS/MS法由于具有特异性好和灵敏度高等诸多优点，是小分子药物生物分析的首选方法。目前，关于人血浆中尼洛替尼浓度分析方法的精度、准确度和灵敏度均有待提高。非同位素内标可能存在基质效应，测定物和内标不能同步变化，影响方法重复性和测定准确度。尼洛替尼人体药动学研究中，尼洛替尼在人体半衰期为20小时左右，给药后采集血液，至少采集至72小时或更长120小时，这对于分析方法的最低定量限要求很高。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的精度、准确度和灵敏度问题。本专利技术采用同位素取代的尼洛替尼([13C,2H3]-Nilotinib)作为内标物，建立人血浆中尼洛替尼的LC-MS/MS测定方法，并按照国家药品监督管理局的相关指导原则的要求对该方法进行验证，从而准确定量检测人血浆样品中的尼洛替尼浓度。通过该方法对尼洛替尼在人体内的药物代谢情况进行探索性研究，以期服务于新药开发(包括一致性评价)。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标[13C,2H3]-Nilotinib溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱柱为AgilentZORBAXEclipseC8，4.6×100mm，3.5μm；流动相：2mmoL/L的含0.1％甲酸的醋酸铵水溶液和甲醇，两者体积比为34：66；柱温为35℃；流速为700μL·min-1；进样量：20μL；(3)质谱测定：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：5500V；离子源温度TEM：650℃；碰撞气CAD：6L·min-1；气帘气CUR：30L·min-1；离子源Gas1：60L·min-1；离子源Gas2：60L·min-1；检测对象的离子选择通道：尼洛替尼，[M+H]+，m/z530.2/289.2，DP120，EP10，CE40，CXP15；内标[13C,2H3]-Nilotinib，[M+H]+，m/z534.2/289.2，P120，EP10，CE40，CXP15；(4)计算：采用内标法，以尼洛替尼和内标[13C,2H3]-Nilotinib的峰面积比值代入标准曲线方程计算尼洛替尼浓度；进一步，步骤(1)具体为：于1.5mL塑料离心管中精密加入受试者血浆样本200μL，精密加入内标500ng·mL-1[13C,2H3]-Nilotinib溶液50μL，旋涡10s，加入610μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心10min；吸取100μL上清液至进样瓶中，加入700μL去离子水，涡旋混匀，进样测定。优选的，所述血浆为口服尼洛替尼胶囊后的血浆。优选的，所述血浆为人或动物口服尼洛替尼胶囊后的血浆有益效果：本专利技术方法与现有技术相比，具有如下优势：(1)预处理方法简便：血浆样品，有机溶剂沉淀蛋白，适用于常规测定。(2)专属性强：采用AgilentZORBAXEclipseC8(4.6×100mm，3.5μm)色谱柱作为固定相；2mmoL/L醋酸铵水溶液(含0.1％甲酸)：甲醇＝34：66作为流动相；尼洛替尼保留时间为3.09min左右；内标[13C,2H3]-Nilotinib保留时间为3.06min左右，10分钟完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。(3)灵敏度高：血浆最低定量限为2.5ng·mL-1。(4)同位素内标：无基质效应，绝对基质效应结果在85％～115％之间。(5)本专利技术方法快速、操作简便、准确、灵敏度高、检测限低。为尼洛替尼的临床血药物浓度测定提供依据，服务于新药研究开发及临床应用。本方法的血浆标准曲线线性范围为2.5～2000ng·mL-1，批内和批间精密度RSD均小于15％。附图说明图1为质谱图。其中，1-A为人空白血浆的质谱图，1-B为人空白血浆加入标准品后的质谱图，1-C为人空腹口服尼洛替尼胶囊片200mg后3h血浆样品的质谱图。注：图中尼洛替尼[M+H]+，m/z530.2/289.2，保留时间为3.09min左右；内标[13C,2H3]-Nilotinib[M+H]+，m/z534.2/289.2，保留时间为3.06min左右。具体实施方式实施例1：人血浆中尼洛替尼浓度的测定；一、实验材料与仪器尼洛替尼对照品：由苏州特瑞药业有限公司提供，批号：b18018；[13C,2H3]-Nilotinib对照品：由Alsachim提供，批号：DH-ALS-16-007-P1；试验用水：超纯水；甲醇、甲酸：色谱纯(MerckCompany)；醋酸铵：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。API4000LC/MS/MS联用仪(美国ABScisex公司)，色谱工作站：Analyst1.6；梅特勒XS105DU电子天平(瑞士梅特勒公司)；EppendorfCentrifuge5424R高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；KDC-2046型低速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；MilliporeDrict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。二、液质条件1.液相色谱条件色谱柱：AgilentZORBAXEclipseC8(4.6×100mm，3.5μm)；流动相：2mmoL/L醋酸铵水溶液(含0.1％甲酸)：甲醇＝34：66；柱温为35℃；流速为700μL·min-1；进样量：20μL；2.质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子极性：正离子；离子源电压IS：5500V；离子源温度TEM：650℃；碰撞气CAD：6L·min-1；气帘气CUR：30L·min-1；离子源Gas1：60L·min-1；离子源Gas2：60L·min-1；检测对象的离子选择通道：尼洛替尼，[M+H]+，m/z530.2/289.2，DP120，EP10，CE40，CXP15；内标[13C,2H3]-Nilotinib，[M+H]+，m/z534.2/289.2，P120，EP10，CE40，CXP15。...

【技术保护点】
1.一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法，包括如下步骤：/n(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标[

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中尼洛替尼浓度的方法，包括如下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标[13C,2H3]-Nilotinib溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；
(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：
色谱柱为AgilentZORBAXEclipse4.6×100mm，3.5μm；
流动相：2mmoL/L的含0.1％甲酸的醋酸铵水溶液和甲醇，两者体积比为34：66；柱温为35℃；流速为700μL·min-1；进样量：20μL；
(3)质谱测定：
离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：5500V；离子源温度TEM：650℃；碰撞气CAD：6L·min-1；气帘气CUR：30L·min-1；离子源Gas1：60L·min-1；离子源Gas2：60L·min-1；检测对象的离子选择通道：尼洛替尼，[M+H]+，m/z530.2/289.2，DP120，EP10，CE40，CXP15；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明，张全英，王蒙，宗顺麟，
申请(专利权)人：苏州大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32